杨 丽1李 莹2王清娴3孙勇兵2刘 湾2李文宏2▲

1.南昌市第九医院，江西南昌 330002；2.江西中医药大学，江西南昌 330004；3.广东省佛山市南海区桂城医院，广东佛山 528200

[摘要]目的探讨不同配比麻黄-杏仁药对中麻黄碱、伪麻黄碱与苦杏仁苷多组分含量的变化规律。方法选用U6（64）均匀设计表安排配比，采用高效液相色谱法测定麻黄-杏仁药对不同配伍比例中麻黄碱、伪麻黄碱与苦杏仁苷的含量。结果 经方法学考察，麻黄碱回归方程为y=212.36x+0.6658，R2=0.9995；伪麻黄碱回归方程为y=184.95x+ 0.7268，R2=0.9990；苦杏仁苷回归方程为y=153.5x+2.4961，R2=0.9990；麻黄与杏仁配伍后，随着配伍比例的变化，麻黄碱、伪麻黄碱的含量与麻黄用量、苦杏仁苷与杏仁用量之间均呈现良好的线性关系。结论 该方法简便、准确、重现性好；麻黄-杏仁药对中有效成分的含量与用药量成正相关，而与配伍比例无明显的相关性。

[关键词]麻黄-杏仁药对；麻黄碱；伪麻黄碱；苦杏仁苷

麻黄辛散苦泄，有效成分主要为麻黄碱和伪麻黄碱，具有发汗、平喘、止咳、祛痰、利尿等药理作用[1-4]，临床上多用于水肿、咳喘、无汗、恶寒发热、外感风寒等症状的治疗[5-6]。杏仁味苦微温，有效成分为苦杏仁苷，主要有祛痰、止咳、平喘、润肠之功效[7-8]。两药配伍使用，麻黄宣肺气，杏仁降肺气，一宣一降，相辅相成[9]。《伤寒论》中麻黄汤、大青龙汤、麻黄杏仁甘草石膏汤、麻黄加术汤、麻黄杏仁薏苡甘草汤、厚朴麻黄汤、文蛤汤等皆为麻黄杏仁合用协同定喘[10-12]。谭晓梅等[13]研究证实了麻黄-杏仁配伍使用后确实比单用麻黄或杏仁有更好的平喘效果，同时降低苦杏仁毒性，并提出麻黄-杏仁能有效改善哮喘状态的作用机制可能与降低嗜酸性粒细胞百分数和血小板数量有关。

中医治疗中，组方剂量配比的不同可能产生不同的治疗作用[3,14-16]。为诠释麻黄-杏仁配伍的科学内涵，本研究选用U6（64）均匀设计表，即对麻黄、杏仁2个因素各取6个不同的水平并设计成6种配比，采用高效液相色谱法 （high performance liquid chromatography，HPLC）同时测定不同配伍比麻黄-杏仁药对中麻黄碱、伪麻黄碱与苦杏仁苷的含量，探讨不同配伍比麻黄-杏仁药对中麻黄碱、伪麻黄碱和苦杏仁苷多组分含量变化规律，为进一步研究不同配伍配比与平喘机制、疗效之间的关系奠定基础。

1.1 仪器

Waters 2998高效液相色谱仪（美国Waters公司）；超声波清洗器（深圳市洁康洗净电器有限公司）；台式大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）；万分之一天平（梅特勒-托利仪器制造厂）。

1.2 试药与试剂

盐酸麻黄碱对照品（国家食品药品检定研究院，批号：171241-201508）；盐酸伪麻黄碱对照品（国家食品药品检定研究院，批号：171237-201208）；苦杏仁苷对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：K01020CB14）；甲醇（山东禹王实业有限公化工公司，批号：20150629033）；磷酸（西陇化工股份有限公司，批号：140913-1）；三乙胺（西陇化工股分有限公司，批号：140222-1）；二正丁胺（国药集团化学试剂有限公司，批号：20150603）；乙腈（天津康巢科技开发有限公司，批号：20131123）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

1.3 药材

经江西中医药大学药学院付小梅副教授鉴定，麻黄为麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica Stapf．的干燥草质茎（产地：甘肃，批号：15091069）；苦杏仁为蔷薇科植物山杏Prunusarmeniaca L．var．ansu Maxim．的干燥成熟种子（产地：河北，炒苦杏仁，批号:15021533）。

1.4 麻黄-杏仁药对水煎液的制备

参照临床煎药方法，按照各配比方量精密称取药材，将称取的麻黄药材加入方药总量8倍的水，浸泡30 min，加热至沸腾，然后改用小火煎煮30 min，加入苦杏仁药材煎煮40 min，趁热过滤，量测煎液总容量，留存20 ml，余下煎液浓缩，定容至1 g生药/ml，煎液和浓缩药液冻存于-20℃备用。

2.1 样品中麻黄碱和伪麻黄碱的HPLC测定

2.1.1 色谱条件 Phenomenex Syncrgi色谱柱（250 mm× 4.6 mm，4 μm，广州菲罗门科学仪器有限公司），流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺）=1.5∶98.5，流速为1.0 ml/min；柱温25℃，检测波长210 nm，进样量10 μl。

按上述色谱条件，分别取麻黄碱-伪麻黄碱混合对照品溶液、麻黄-杏仁药对供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，结果如图1。

 

图1 麻黄碱-伪麻黄碱HPLC测定结果

A.麻黄碱-伪麻黄碱混合对照品；B.麻黄-杏仁药对供试品；C.阴性对照

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品麻黄碱0.0162 g、伪麻黄碱0.0157 g，分别用80%甲醇适量溶解，超声5 min，置50 ml容量瓶中，定容；另取配制后等容量麻黄碱和伪麻黄碱溶液混合制成混合对照品溶液；配制得到浓度为1.62 μg/ml（麻黄碱）及1.52 μg/ml（伪麻黄碱）的混合对照品储备液。

2.1.3 供试品溶液的制备 将备用冻存煎液37℃水浴解冻，室温静置2 h，吸取1.5 ml，15 000 r/min离心10 min，取上清液，0.22 μm微孔膜滤过，取滤液作为供试品溶液。

2.1.4 阴性溶液的制备 按“2.1.3”项下方法制备得到不含麻黄的阴性对照样品。

2.1.5 标准曲线的制作 精确吸取麻黄碱、伪麻黄碱对照品储备液1、2、4、6、8、10 ml分别置于10 ml容量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，制得系列浓度梯度的标准曲线溶液。溶液经0.22 μm有机微孔滤膜滤过后，分别进样10 μl，按2.1.1所述色谱条件进行HPLC检测分析，记录峰面积。以质量浓度（μg/ml，x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线。麻黄碱回归方程为y=212.36x+0.6658，R2=0.9995；伪麻黄碱回归方程为y=184.95x+0.7268，R2=0.9990。

2.2 样品中苦杏仁苷的HPLC测定

2.2.1 色谱条件 Agilent TC色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液15∶85，流速为1.0 ml/min；柱温35℃，检测波长210 nm。进样量10 μl。

按上述色谱条件，取苦杏仁苷对照品溶液、麻黄-杏仁药对供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，结果如图2。

 

图2 苦杏仁苷HPLC测定结果

A.苦杏仁苷对照品；B.麻黄-杏仁药对供试品；C.阴性对照

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品苦杏苷0.0156 g，用80%甲醇适量溶解，超声5 min，置50 ml容量瓶中，定容，配制得到浓度为3.12 μg/ml的对照品储备液。

2.2.3 供试品溶液的制备 将“2.1.3”项下的备用冻存煎液37℃水浴解冻，室温静置 2 h，吸取 1.5 ml，15000 r/min离心10 min，取上清液，0.22 μm微孔膜滤过，取滤液作为供试品溶液。

2.2.4 阴性溶液的制备 按“2.1.3”项下方法制备得到不含苦杏仁苷的阴性对照样品。

2.2.5 标准曲线的制作 精确吸取苦杏仁苷对照品储备液1、2、4、6、8、10 ml分别置于10 ml容量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，制得系列浓度梯度的标准曲线溶液。溶液经0.22 μm有机微孔滤膜滤过后，分别进样10 μl，按“2.2.1”项下色谱条件进行HPLC检测分析，记录峰面积。以质量浓度（μg/ml，x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线。苦杏仁苷回归方程为y=153.5x+2.4961，R2=0.9990。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 分别精密吸取麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷对照品溶液各10 μl，连续进样6次，记录峰面积。结果麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为0.11%、0.09%、0.17%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 按照“2.1.3”项下方法平行制备麻黄-杏仁药对供试品溶液6份，0.22 μm微孔滤膜滤过，进样10 μl，分别测定供试品溶液中麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷的峰面积。结果样品中麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷峰面积 RSD分别为 1.54%、1.89%、0.93%，表明本文建立的HPLC检测方法有着良好的重复性。

2.3.3 稳定性试验 取麻黄-杏仁药对供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12、24 h后进样10 μl，记录峰面积。结果样品中麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷峰面积RSD分别为0.78%、1.22%、1.04%，表明在24 h内供试品溶液稳定。

2.3.4 加样回收率试验 按照“2.1.3”项下方法平行制备麻黄-杏仁药对供试品溶液9份，分别精密加入高、中、低3个浓度麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷对照液1 ml（每个浓度3份），按上述色谱条件对三种成分进行检测，计算回收率。结果麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷的平均加样回收率分别为 98.08%、99.78%、98.56%，RSD值分别为2.69%、1.55%、1.18%。

2.4 样品测定

选用均匀设计表Un（ns）来规划实验，其中s为待考察因素，n为实验次数和水平数。即对麻黄、杏仁两个因素各取6个不同的水平并设计成6种配比进行考察，选用U6（64）表。麻黄的药典用量为1.5～10.0 g，杏仁的药典用量为4.5～9.0 g。生药总量100 g，均匀设计实验配比方案，结果如表1。

表1 麻黄-杏仁药对均匀设计实验配比方案

参照临床煎药方法，按照上表中各配比方量称取药材，将称取的麻黄药材加入方药总量8倍的水，浸泡30 min，加热至沸腾，然后改用小火煎煮30 min，加入苦杏仁药材煎煮40 min，趁热过滤，即得供试品溶液。供试品溶液各6份，分别进样10 μl，依次测定样品中麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷的含量，折算成1 g生药/ml的含量，结果如表2。

表2 各配比麻黄-杏仁药对麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷的含量（mg/ml，，n=6）

从表2可以看出，随着麻黄用量的增加，麻黄碱和伪麻黄碱的含量也随之增加。分别以麻黄用药量为横坐标（x），麻黄碱或伪麻黄碱含量为纵坐标（y），得线性回归方程分别为y=0.0307x+0.2316，R2=0.9908；y=0.0397x-0.0033，R2=0.9967，表明麻黄碱和伪麻黄碱在麻黄-杏仁药对中的含量与麻黄的用量呈现良好的线性关系。

随着杏仁用量的增加，苦杏仁苷的含量也随之增加。以杏仁用药量为横坐标（x），苦杏仁苷含量为纵坐标（y），得线性回归方程为 y=0.2015x+0.9631，R2= 0.9969，表明苦杏仁苷在麻黄-杏仁药对中的含量与杏仁的用量亦呈现良好的线性关系。且配伍比例的改变对麻黄碱、伪麻黄碱和苦杏仁苷的含量均无明显影响。

3.1 分析方法选择

目前文献中报道的麻黄碱和伪麻黄碱定量方法主要有HPLC[11,17-18]和气相色谱质谱联用法（GC-MS）[19-20]两种；苦杏仁苷常用的定量方法有HPLC[21]和液相色谱-四极杆飞行时间质谱法（UPLC-QTOF-MS/MS）[22]。分析比较发现，HPLC、GC-MS和UPLC-QTOF-MS/ MS分别用于麻黄碱、伪麻黄碱和苦杏仁苷定量时，均有分离度高、稳定性好的特点，又因HPLC设备使用维修成本较低，是目前应用最为广泛的药物分析方法，故本研究选用HPLC对麻黄-杏仁药对中麻黄碱、伪麻黄碱和苦杏仁苷进行定量分析。

3.2 流动相考察

以不同比例的甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸作为流动相考察，以甲醇-0.1%磷酸溶液 （1.5∶98.5）为流动相测定麻黄碱和伪麻黄碱时，以甲醇-0.1%磷酸溶液（15∶85）为流动相时测定苦杏仁苷，峰型与分离效果均最佳。

3.3 供试品溶液的选择

为了更为准确地测定各组分含量，且与对照品有更好的可比性，本研究对供试品溶液进行了筛选。将1 g生药/ml浓缩药液作为供试品，结果响应值相对过大；将浓缩液分别稀释5、20、40倍后作为供试品，响应值均相对不佳，且检测取样微量，考虑到稀释过程对备用冻存浓缩液微量取样也存在影响，故最终选择未浓缩煎液作为供试样品，响应值相对较好，与对照品可比性好。测定其中各组分含量，再折算成1 g生药/ml的浓度。用该方法计算得到的含量准确可靠，可以作为麻黄-杏仁药对质量监控方法。

3.4 不同配伍比对麻黄-杏仁药对中麻黄、伪麻黄、苦杏仁苷含量的影响

实验结果可见，随着配伍比例的变化，麻黄碱、伪麻黄碱的含量与麻黄用量（R2分别为0.9908和0.9967）、苦杏仁苷和杏仁用量之间（R2=0.9969）均呈现良好的线性关系；而配伍比例的改变对麻黄碱、伪麻黄碱和苦杏仁苷的含量均无明显影响，表明配伍比例对有效成分的含量无明显影响，结果与文献报道相一致[16]。而不同配伍比对麻黄-杏仁药对的药动学及药效学影响均有待于进一步研究。

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Study on the change rule between different compatibility of ephedra-amond drugs and the concentration of effective components

YANG Li1LI Ying2WANG Qing-xian3SUN Yong-bing2LIU Wan2LI Wen-hong2▲
1.The Ninth Hospital of Nanchang City,Jiangxi Province,Nanchang 330002,China;2.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Jiangxi Province,Nanchang 330004,China;3.Guicheng Hospital of Nanhai District in Foshan City, Guangdong Province,Foshan 528200,China

[Abstract]Objective To discuss the change rule between the different compatibility of ephedra-almond drugs and the multicomponent content variation of ephedrine,pseudo-ephedrine and amygdalin.Methods The U6（64）uniform design table was selected to plan proportions,and a simultaneous quantitative HPLC method was used for determination of the content of ephedrine,pseudo-ephedrine and amygdalin in different compatibility of ephedra-almond drugs.Results The regression equation of ephedrine was y=212.36x+0.6658,R2=0.9995;the regression equation of pseudo-oephedrine was y=184.95x+0.7268,R2=0.9990;the regression equation of amygdalin was y=153.5x+2.4961,R2=0.9990.After compatibility of ephedra and almond,the content of ephedrine,pseudo-ephedrine and ephedrine,amygdalin and almond showed a good linear relationship with the compatibility ratio.Conclusion The method is simple,accurate and reproducible.The content of effective components of ephedra-almond drugs and dose is positive correlation,but it has no obvious correlation with compatibility proportion.

[Key words]Ephedra-almond drugs;Ephedrine;Pseudo-ephedrine;Amygdalin

[中图分类号]R285.5

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）02（b）-0004-05

（收稿日期：2016-11-10本文编辑：任 念）

[基金项目]国家自然科学基金项目（81460610）

[作者简介]杨丽（1977-），女，江西中医药大学2014级药学专业在读硕士研究生，研究方向：基础药学

▲通讯作者：李文宏（1974-），男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药药理学