李铭

广西壮族自治区北海食品药品检验所，广西北海 536000

[摘要]目的 建立测定葆宫止血颗粒中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1以及人参皂苷Rb1含量的HPLC法。方法 采用安捷伦Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm），以乙腈-水为流动相梯度洗脱，流速为1.0 ml/min，检测波长为203 nm。结果 三七皂苷R1和人参皂苷Rg1，Rb1的线性范围分别为0.277～5.540 μg（r=0.9998），0.253～5.060 μg（r=0.9998），0.262～5.230 μg（r=0.9997）。平均加样回收率分别为89.5%（RSD=2.70%）、91.0%（RSD=1.87%）和90.8%（RSD= 1.74%）（n=6）。结论 该方法快速简便，专属性强，结果准确，可用于葆宫止血颗粒中三七的质量控制。

[关键词]葆宫止血颗粒；三七皂苷R1；人参皂苷Rg1；人参皂苷Rb1；高效液相色谱法

葆宫止血颗粒是由牡蛎、白芍、侧柏叶、地黄、金樱子、柴胡、三七、仙鹤草、椿皮、大青叶等十味药制成的中药复方制剂，为国家药品标准新药转正标准中药第六十九册收载品种，具有固经止血，滋阴清热之功效，临床上用于冲任不固、阴虚血热所致月经过多、经期延长，经色深红、质稠，或有小血块、腰膝酸软、咽干口燥、潮热心烦、舌红少津、苔少或无苔、脉细数；功能性子宫出血及上环后子宫出血等症状。葆宫止血颗粒其质量标准中对三七只有薄层鉴别而未做含量测定，为进一步完善此产品的质量标准，有效地进行全面质量控制，有必要对三七的有效成分进行含量测定。目前测定三七主要有效成分含量的方法多采用高效液相色谱法梯度洗脱[1-17]，选用紫外检测器[1-14]、蒸发光检测器[15-17]进行测定。也有用超高效液相色谱法[18]测定三七中的有效成分，但该法对仪器要求比较高，设备较昂贵，不易普及。本文参考文献报道[1-14]，研究建立同时测定葆宫止血颗粒中三七主要有效成分三七皂苷R1、人参皂苷Rg1以及人参皂苷Rb1含量的高效液相色谱方法。该方法操作简便，专属性强，结果准确可靠，可用于该制剂中三七的质量控制。

美国安捷伦1260高效液相色谱仪,包括低压四元梯度泵，真空脱气机，二极管阵列紫外检测器，自动进样器，柱温箱；AE240电子分析天平（十万分之一，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）

人参皂苷Rb1对照品（批号：110704-200921，中国食品药品检定研究所提供，供含量测定用）；人参皂苷Rg1对照品（批号：110703-201027，中国食品药品检定研究所提供，供含量测定用）；三七皂苷R1对照品（批号：110745-201318，中国食品药品检定研究所提供，供含量测定用）；葆宫止血颗粒 （批号：1403013，1407050，1505005），为市售品；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他检测用试剂为分析纯。

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm）；流动相：A相为乙腈，B相为水，梯度洗脱，0～60 min（10%～60%A），60～70 min（60%A），70～80 min（60%～10%A），80～95 min（10%A）；流速：1.0 ml/min；检测波长为203 nm；进样量为10 μl；柱温为30℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷减压干燥24 h的人参皂苷Rb1对照品10.46 mg，人参皂苷Rg1对照品10.12 mg，三七皂苷R1对照品11.08 mg，分别置于20 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液。精密量取上述人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1，三七皂苷R1对照品储备液各5 ml置20 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1毫升中含人参皂苷Rb1130.75μg，人参皂苷Rg1126.5μg,三七皂苷R1138.5 μg的对照品混合溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品5包内容物，精密称定，研细，称取约7.5 g细粉重量，置于50 ml量瓶中，加甲醇约40 ml，超声处理30 min，取出放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，滤液水浴蒸干，残渣加水10 ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次10 ml，合并正丁醇提取液，用水洗涤2次，每次15 ml，取正丁醇液，水浴蒸干，残渣用9 ml甲醇分3次溶解转移至10 ml量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液。

2.2.3 三七阴性对照溶液的制备 按药品标准中的处方和制法制备不含三七的阴性样品，照供试品溶液的制备方法操作制备三七阴性对照溶液。

2.3 方法专属性试验

精密量取上述对照品混合溶液，供试品溶液，阴性对照溶液各10 μl注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图，结果三七皂苷R1的保留时间为21.3min，人参皂苷Rg1的保留时间为22.8min，人参皂苷Rb1的保留时间为32.5 min，样品各组分分离良好，阴性样品对三七皂苷R1和人参皂苷Rg1以及人参皂苷Rb1的测定无干扰，表明此方法的专属性良好，见图1。

 

图1 HPLC色谱图

A.对照品；B.样品；C.阴性样品；1.三七皂苷R1；2.人参皂苷Rg1；3.人参皂苷Rb1

2.4 线性关系考察试验

分别精密吸取对照品混合溶液2，4，10，20，40 μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标，进样量（X）为横坐标进行线性回归，求得回归方程Y人参皂苷Rb1=2.26×102X+0.446（r=0.9997），Y人参皂苷Rg1=6.44×102X+0.50（r=0.9998），Y三七皂苷R1=1.41×102X+0.17（r=0.9998）。结果表明，人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1，三七皂苷R1峰面积与进样量在0.262～5.230 μg，0.253～5.060 μg，0.277～5.540 μg范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

取对照品混合溶液10 μl，注入高效液相色谱仪，连续进样5次，测得三七皂苷R1峰面积的RSD为0.51%，人参皂苷Rg1峰面积的RSD为0.42%，人参皂苷Rb1峰面积的RSD为0.66%，表明分析方法精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一份供试品溶液10 μl,分别在0、2、4、6、8、10、12 h进行测定，按上述色谱条件下测定，记录峰面积。结果三七皂苷R1峰面积的 RSD为0.84%，人参皂苷Rg1峰面积的RSD为0.75%，人参皂苷Rb1峰面积的RSD为1.1%。测定结果表明在12 h内供试品溶液中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积无明显变化，供试品溶液在12 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批号样品（批号：1403013）共6份，按供试品溶液的制备方法平行配制六份供试品溶液，同法测定，测得三七皂苷R1的含量为3.72 mg/包，RSD为2.33%，人参皂苷Rg1的含量为3.38 mg/包，RSD为1.75%，人参皂苷Rb1的含量为4.10 mg/包，RSD为1.88%，表明方法有较好的重复性。

2.8 加样回收率试验

取同一批号（批号：1403013，平均装量：15.316 g/包）的已知含量样品5包，取颗粒研细混匀，称取约3.75 g细粉重量，精密称定，共6份，分别置50 ml量瓶中，精密加入上述3种对照品储备液各1 ml，加甲醇约40 ml，按“2.2.2”项下方法操作制备供试品溶液，按上述色谱条件下测定，计算加样回收率，结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的平均回收率分别为89.5%（RSD为2.70%），91.0%（RSD为1.87%），90.8%（RSD为1.74%）（表1）。

表1 加样回收率试验结果（n=6）

2.9 样品含量测定

分别精密称取不同批的葆宫止血颗粒，按上述供试品溶液的制备方法配制供试品溶液，分别精密吸取对照品混合溶液和供试品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，用外标法以峰面积计算含量。3个批号样品中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1以及人参皂苷Rb1的含量测定结果见表2。

表2 样品测定结果（mg/包）（n=3）

3.1 流动相的选择

由于本品为中药复方制剂，影响含量测定的干扰因素也较多，色谱图中的峰较多，故对分离度要求较高。参考文献[1-4]方法中的流动相测定均不理想。后经过探索乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸溶液，甲醇-0.1%磷酸溶液等不同的洗脱体系，不同的梯度洗脱程序，最终采用乙腈-水洗脱体系，按方法“2.1”项下的梯度洗脱程序使三七中3种主要的皂苷类成分获得完全分离，峰形、理论板数都比较理想，基线漂移不明显，该色谱条件可用于该制剂的含量测定。

3.2 检测波长的选择

通过紫外扫描，得到三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1三者均在200～210 nm有较大吸收峰，再通过实验考察表明在波长为203 nm时三者均有较好的响应值，故本实验选择检测波长为203 nm。

3.3 样品的提取

文献报道中样品的提取方法有甲醇超声提取[5-8]、70%乙醇超声提取[9]、水饱和的正丁醇超声提取[10]、甲醇微沸2 h提取[11]、甲醇加热回流1～2 h提取[12-14]。由于样品中的三七总皂苷易溶于甲醇，综合考虑操作的简便，采取对样品加甲醇进行超声提取，本实验通过对不同超声提取时间（10、20、30、40、50 min）进行考察，结果显示超声提取30 min就可使样品中的三七总皂苷完全提取出来，提取液经水浴蒸干，残渣加水溶解后，再用水饱和的正丁醇振摇提取，去除样品中的一些其他成分干扰，本实验通过对不同水饱和的正丁醇提取液体积（20，10 ml）,提取次数（2，3次）的进行考察，经实验考察用水饱和的正丁醇提取3次（10，10，10 ml）就可将三七总皂苷提取完全。

3.4 检测器的选择

相关文献[15-17]采用蒸发光散射检测器测定三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1，其作为一种通用型检测器，由于流动相在检测前就已蒸发，提高了基线的稳定性，不会产生基线漂移，但由于该检测器的基线噪音大，也影响了检测的灵敏度，而采用紫外检测器，基线噪音小，并且采用合理的梯度洗脱程序，使得基线漂移并不明显。另外蒸发光散射检测器测定时样品浓度与峰面积呈对数线性关系，因此要采用对数计算。考虑测定和计算的简便性，最终采用紫外检测器进行测定。

3.5 本实验方法的优点

本实验采用HPLC法梯度洗脱同时测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的含量，经方法学研究，结果表明该方法重复性好，稳定性高，回收率好，专属性较强。且方法操作简便，结果准确可靠，可用于葆宫止血颗粒中三七的质量控制。

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Determination of the content of Notoginsenoside R1,Ginsenoside Rg1and Rb1in Uterus-Repairing Hemostasis Granules by using HPLC

LI Ming
Beihai Institute for Food and Drug Control in Guangxi Zhuang Autonomous Region,Beihai 536000,China

[Abstract]Objective To establish the determination of the content of Notoginsenoside R1,Ginsenoside Rg1and Rb1in Uterus-Repairing Hemostasis Granules by using HPLC.Methods By using the Agilent Eclipse XDB-C18column(250 mm× 4.6 mm),the acetonitrile-water was adopted to perform mobile phase gradient elution at flow rate of 1.0 ml/min;and the detection wavelength was 203 nm.Results The linear scope of Notoginsenoside R1,Ginsenoside Rg1and Rb1ranged from 0.277 to 5.540 μg(r=0.9998),from 0.253 to 5.060 μg(r=0.9998),from 0.262 to 5.230 μg(r=0.9997).The average recovery rate was 89.5%(RSD=2.70%),91.0%(RSD=1.87%)and 90.8%(RSD=1.74%)(n=6).Conclusion As a simple,reproducible and accurate method,it can be used for quality control of pseudo-ginseng in Uterus-Repairing Hemostasis Granules.

[Key words]Uterus-Repairing Hemostasis Granules;Notoginsenoside R1;Ginsenoside Rg1;Ginsenoside Rb1;HPLC

[中图分类号]R927.2

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）02（a）-0016-04

（收稿日期：2016-12-09本文编辑：顾雪菲）