左 凯1薛 栋2▲孔 丽3夏修良2

1.山东省滨州市人民医院感染二科，山东滨州 256610；2.山东省滨州市人民医院普外一科，山东滨州 256610；3.山东省滨州市人民医院静配中心，山东滨州 256610

[摘要]目的 探讨肝癌组织中富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2（proline-rich tyrosine kinase-2，Pyk2）、Twist和E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达及临床意义。方法 收集滨州市人民医院2006年2月～2012年2月手术切除的80例肝癌组织标本作为研究对象，其中配对癌旁组织（距离癌组织边缘＜3 cm）50例。采用免疫组化EnVision法检测Pyk2、Twist和E-cadherin蛋白的表达，并分析其与临床病理特征和侵袭转移的关系。结果 Pyk2在肝癌组织及癌旁肝组织中的阳性表达率分别为71.3%、12.0%，差异有统计学意义（P＜0.05）；Twist在肝癌组织及癌旁肝组织中的阳性表达率分别为66.3%、6.0%，差异有统计学意义（P＜0.01）；E-cadherin在肝癌组织及癌旁肝组织中的阳性表达率分别为27.5%、90.0%，差异有统计学意义（P＜0.01）。Pyk2、Twist和E-cadherin蛋白阳性表达与肝癌病理分级、分化程度、血管侵犯及TNM分期均明显相关（P＜0.05），肝癌组织中，Pyk2与Twist表达成正相关（P＜0.05），Pyk2和E-cadherin表达成负相关（P＜0.05），Twist和E-cadherin表达也成负相关（P＜0.05）。结论Pyk2、Twist及E-cadherin共同参与了肝癌的发生、发展，Pyk2可能通过上调Twist的表达促进肝癌侵袭转移。

[关键词]肝细胞癌；富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2；Twist；E-钙黏蛋白；免疫组织化学

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系统较常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年上升趋势。肝癌恶性程度高，早期缺乏特异性症状，5年生存率较低[1]。部分肝癌患者确诊时就出现了肝内转移、门静脉癌栓甚至远处转移，失去了手术切除机会，因此，寻找肝癌早期诊断和临床治疗的分子标志物已成为一个亟待解决的问题。富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2（proline-rich tyrosine kinase-2，Pyk2）是一种非受体型蛋白酪氨酸激酶，是黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）家族的一个新成员，在肿瘤细胞增殖、侵袭转移等过程中发挥重要作用[2]。国内外研究已证实，Pyk2在神经胶质细胞瘤[3]、非小细胞肺癌[4]、膀胱癌[5]等肿瘤组织中高表达，并且与肿瘤分期及转移密切相关。Twist基因是碱性螺旋-环-螺旋（basic helix loop helix，bHLH）转录因子家族的一个重要成员，Twist与肿瘤侵袭、转移密切相关[6]。上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是促进肿瘤细胞侵袭转移的一个重要机制。E-钙黏蛋白（E-cadherin）是上皮间质转化的重要标志分子[7]。本研究采用免疫组织化学EnVision方法探讨Pyk2、Twist及E-cadherin在肝癌中的表达及临床肿瘤学意义，旨在为临床靶向治疗肝癌提供一定的理论依据。

1.1 一般资料

选取2006年2月～2012年2月滨州市人民医院肝细胞癌手术切除的80例临床标本，其中配对癌旁组织（距离癌组织边缘＜3 cm）50例；男性56例，女性24例；年龄33～79岁；53例肿瘤直径＜5 cm，27例肿瘤直径≥5 cm。所有标本病理诊断均为原发性肝细胞癌，术前未接受过放、化疗等抗肿瘤治疗。临床分期（2010年国际抗癌联盟标准）：Ⅰ、Ⅱ期共51例，Ⅲ、Ⅳ期共29例。

1.2 试剂和方法

选取病理科存档的肿瘤组织蜡块，病理科医师重新切片诊断，进一步行病理学分级，分别实施Pyk2、Twist和E-cadherin免疫组织化学染色，应用免疫组化EnVision法检测Pyk2、Twist和E-cadherin蛋白的表达。兔抗人Pyk2单克隆抗体、兔抗人Twist多克隆抗体及兔抗人E-cadherin多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司，工作浓度均为1∶200。EnVision试剂盒购自丹麦Dako公司，操作步骤按试剂盒说明书进行。同时设阳性和阴性对照，阳性对照为试剂公司提供的强阳性标本切片，阴性对照采用磷酸盐缓冲溶液代替一抗。

1.3 结果判定

Pyk2蛋白阳性：细胞质内出现棕黄色或棕褐色颗粒；Twist蛋白阳性：细胞质内出现棕黄色颗粒；E-cadherin蛋白阳性：细胞膜和（或）细胞质内出现棕黄色颗粒。在不知任何背景资料的情形下，由两位病理专家采用双盲法进行阅片。首先依据染色强度打分，无染色记为0分，淡黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分，染色需与背景着色相比较。再将阳性细胞所占的百分比进行打分，无阳性细胞记为0分，阳性细胞所占百分比为1%～25%记为1分，阳性细胞所占百分比为＞25%～50%记为2分，阳性细胞所占百分比为＞50%～75%记为3分，阳性细胞所占百分比为＞75%～100%记为4分。最后根据染色强度与阳性细胞百分比乘积进行评分，≥4分记为阳性表达，＜4分记为阴性表达。

1.4 统计学分析

采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行分析，计数资料采用χ2检验，等级相关检验采用Spearman等级相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 肝癌组织及癌旁组织中Pyk2蛋白的表达

Pyk2阳性染色主要位于细胞质，细胞核未见明显染色，染色为棕黄色或棕褐色，呈小片状或弥漫性分布 （图1）。Pyk2在肝癌组织中的阳性表达率为71.3%，在癌旁肝组织中的阳性表达率为12.0%，两种肝组织中的阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

 

图1 Pyk2阳性染色（免疫组化染色EnVision，×200）

表1 肝癌和癌旁肝组织中Pyk2、Twist及E-cadherin表达情况的比较（n）

2.2 肝癌组织及癌旁组织中Twist蛋白的表达

Twist蛋白的阳性着色位于细胞质，为棕黄色颗粒（图2）。Twist在肝癌组织中的阳性表达率为66.3%，而在癌旁肝组织的阳性表达率为6.0%，两种肝组织中的阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.01）（表1）。

 

图2 Twist阳性染色（免疫组化染色EnVision，×200）

2.3 肝癌组织及癌旁组织中E-cadherin蛋白的表达

E-cadherin蛋白的阳性着色主要位于细胞膜或细胞质，呈棕黄色或棕褐色颗粒（图3）。E-cadherin在肝癌组织中的阳性表达率为27.5%，而在癌旁肝组织的阳性表达率为90.0%，两种肝组织中的阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.01）（表1）。

 

图3 E-cadherin阳性染色（免疫组化染色EnVision，×200）

2.4 Pyk2、Twist和E-cadherin蛋白表达与肝癌临床病理特征的关系

肝癌中Pyk2阳性表达与患者年龄、性别、AFP、肿瘤大小及包膜完整性无关（均P＞0.05），与病理分级、肿瘤分化、血管侵犯及临床TNM分期有关（均P＜0.05）。肝癌组织中Twist阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、AFP及包膜完整性无关（均P＞0.05），与病理分级、肿瘤分化、血管侵犯及TNM分期有关（均P＜0.05）。肝癌组织中E-cadherin阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、AFP及包膜完整性无关（均P＞0.05），与病理分级、肿瘤分化程度、血管侵犯及TNM分期有关（均P＜0.05）。Pyk2、Twist共同高表达于分化程度低、血管侵犯、病理分级较差及分期较晚的肝癌组织中（表2）。

表2 肝癌临床病理参数与Pyk2、Twist及E-cadherin表达的关系

2.4 Pyk2、Twist和E-cadherin在肝癌组织中表达的关系

Spearman等级相关分析显示，肝癌组织中Pyk2与Twist蛋白表达成正相关（r=0.425，P=0.032），Pyk2与E-cadherin的表达成负相关（r=-0.472，P=0.026）；Twist与E-cadherin的表达也成负相关（r=-0.308，P=0.037）。

Pyk2是一种富含脯氨酸的非受体酪氨酸蛋白激酶，定位于人第8号染色体（8p21.1），基因全长4.048kbp。Pyk2依赖于钙离子浓度的变化而被激活，调控细胞增殖、分化及侵袭[8-10]。Pyk2能诱导乳腺癌细胞发生上皮间质转化，促进肿瘤细胞侵袭和迁移[11]。本研究结果显示，Pyk2在肝癌组织中高表达，在肝癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁肝组织（P＜0.05），提示Pyk2基因与肝癌的发生、发展有关。进一步的研究还显示，Pyk2阳性表达还与病理分级、肿瘤分化、血管侵袭及TNM分期密切相关，提示Pyk2能在肝癌细胞分化、侵袭转移过程中发挥重要作用。

Twist不仅在胚胎形态发生中起关键调控作用，还参与调控肿瘤细胞增殖分化、侵袭转移等过程[12]。胰腺癌中Twist高表达，并且与肿瘤分期、侵袭转移密切相关[13]。结直肠癌中也存在Twist高表达，并且沉默Twist基因后结直肠癌细胞增殖及迁移力显著下降[14]。本研究结果显示，Twist在肝癌组织中的表达率明显高于癌旁肝组织（P＜0.05），并且Twist阳性表达还与病理分级、肿瘤分化、血管侵袭及临床TNM分期有关（P＜0.05），提示Twist在肝癌侵袭转移过程中发挥重要作用。Twist在低分化、中晚期的肝癌中的表达明显增强，进一步支持了Twist参与肝癌恶性进展，这与车娜等[15]的研究报道一致。相关性分析显示，Pyk2与Twist在肝癌中的表达成正相关（P＜0.05），提示Pyk2与Twist共同参与了肝癌恶性侵袭，推测Pyk2可能通过上调Twist促进了肝癌侵袭、转移。

上皮间质转化是肿瘤细胞获得侵袭和迁移能力的重要机制，当E-cadherin表达下调时，细胞间的黏附力下降，最终导致肿瘤细胞侵袭及转移[16]。E-cadherin在甲状腺乳头状癌组织中低表达，其表达与临床分期及淋巴结转移密切相关[17]。本研究结果显示，E-cadherin在肝癌组织中的阳性表达率显著低于癌旁肝组织，E-cadherin阳性表达与病理分级、肿瘤分化、血管侵袭及TNM分期有关（P＜0.05），提示E-cadherin与肝癌侵袭转移密切相关。本研究结果还显示，Pyk2、Twist及E-cadherin在肝癌组织中异常表达，并且三者密切相关，提示Pyk2、Twist及E-cadherin在肝癌侵袭转移过程中发挥了协同作用。

综上所述，肝癌组织中存在Pyk2、Twist及E-ca dherin异常表达，其共同参与了肝细胞的癌变及恶性侵袭转移过程。Pyk2可能为肝癌的诊断和治疗提供一个新的分子靶点。

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Expression and clinical signifance of Pyk2,Twist and E-cadherin in hepatocellular carcinoma

ZUO Kai1XUE Dong2▲KONG Li3XIA Xiu-liang2
1.Department ofthe Second Infectious Diseases,People′s Hospital of Binzhou City in Shandong Province,Binzhou 256610,China;2.Department ofthe First General Surgery,People′s Hospital of Binzhou City in Shandong Province, Binzhou 256610,China;3.Intravenous Infusion Center,People′s Hospital of Binzhou City in Shandong Province,Binzhou 256610,China

[Abstract]Objective To explore the expressions of Pyk2,Twist and E-cadherin in hepatocellular carcinoma and their clinical significance.Methods 80 hepatocellular carcinoma tissues in our hospital from February 2006 to February 2012 were selected as the research objects,and 50 cases of adjacent paracancerous tissues were matched (from the edge of cancer tissue to less than 3 cm).Immunohistochemistry of EnVision was used to detect the expression of Pyk2,Twist and E-cadherin in hepatocellular carcinomas and adjacent paracancerous tissues.The correlation between their expression and pathologic parameters were analyzed by statistics.Results The positive rate of Pyk2 in hepatocellular carcinomas was significantly higher than that in adjacent paracancerous tissues,with significant difference (71.3%vs.12.0%,P＜0.05).Significant differences were also observed in the positive expression rate of Twist between the patients with hepatocellular carcinomas and paracancerous tissues(66.3% vs.6.0%,P＜0.01).The positive rate of E-cadherin in hepatocellular carcinomas was significantly lower than that in adjacent paracancerous tissues(27.5%vs.90.0%, P＜0.01).The positive expression of Pyk2,Twist,E-cadherin was significantly correlated with pathological grade,degreeof differentiation,vascular invasion and clinical TNM stage (P＜0.05).The expression of Pyk2 was positively correlated with the expression of Twist in hepatocellular carcinoma (P＜0.05),the expression of Pyk2 was negatively correlated with the expression of E-cadherin (P＜0.05),and the expression of Twist was negatively correlated with the expression of E-cadherin(P＜0.05).Conclusion Pyk2,Twist and E-cadherin protein expression might be associated with the development, invasion,and metastasis of hepatocellular carcinoma.Pyk2 may play a role during invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma by up-regulating the expression of Twist.

[Key words]Hepatocellular carcinoma;Proline-rich tyrosine kinase-2;Twist;E-cadherin;Immunohischemistry

[中图分类号]R735.7

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）02（a）-0004-04

（收稿日期：2016-12-26本文编辑：祁海文）

[基金项目]山东省滨州市科技发展计划（政策引导类）项目（2014ZC0128）

[作者简介]左凯（1973-），男，硕士，主治医师，研究方向：急慢性肝炎、肝肿瘤等

▲通讯作者：薛栋（1980-），男，博士，主治医师，研究方向：肝胆胰、微创外科