李自立 章若涵

南华大学附属南华医院心血管内科，湖南衡阳 421002

[摘要]目的探讨白藜芦醇对血管紧张素Ⅱ诱导的平滑肌细胞增殖的抑制作用。方法体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞（VSMCs），将细胞分为血管紧张素组、白藜芦醇梯度组、联合组及对照组，检测评价白藜芦醇和血管紧张素对VSMCs增殖能力的影响，各组均反应0、6、12、24 h，根据细胞计数来评价VSMCs的增殖情况，采用MTT比色法检验VSMCs活力，对结果进行对比分析。结果从各组的细胞计数结果来看，总体结果为血管紧张素组＞联合组＞白藜芦醇梯度组＞对照组，其中血管紧张素组VSMCs的细胞计数结果显著高于对照组，培养24 h时,白藜芦醇梯度组中30 μmol/L浓度下细胞计数最低（P＜0.05），而联合组中30、100 μmol/L浓度下细胞计数均显著低于10 μmol/L（P＜0.05）；从各组细胞活力情况来看，总体结果为血管紧张素组＞联合组＞白藜芦醇梯度组＞对照组,培养24 h时,同样白藜芦醇梯度组中30 μmol/L浓度下细胞计数最高（P＜0.05），而联合组中30、100 μmol/L浓度下细胞计数均显著低于10 μmol/L（P＜0.05）。结论白藜芦醇对于血管平滑肌细胞增殖有着一定的作用，且对于血管紧张素Ⅱ所诱导的增殖有着较强的抑制效果，不同浓度下作用效果有所差异。

[关键词]平滑肌细胞；白藜芦醇；血管紧张素Ⅱ；细胞增殖

动脉粥样硬化症是多种心脑血管疾病的基础，相关研究显示，炎症因子刺激下主动脉血管平滑肌细胞（VSMCs）增生是导致动脉粥样硬化发生发展的一个重要因素[1-2]。近年来红酒中的提取物白藜芦醇在心血管疾病防治中的作用逐渐被重视，有学者研究显示白藜芦醇能够有效抑制冠心病模型大鼠动脉粥样硬化的程度[3]。血管紧张素Ⅱ是一种生物活性肽，具有较强的收缩血管、刺激心肌肥大的作用，同时也能够促进VSMCs的增殖，血管紧张素Ⅱ诱导下的VSMCs增殖是导致动脉粥样硬化发生的重要病理基础[4]。本文就白藜芦醇对血管紧张素Ⅱ诱导的平滑肌细胞增殖的抑制作用进行了研究分析，现报道如下。

1.1 材料与试剂

清洁剂SD大鼠4～5只，均由南华大学实验动物学部动物实验中心提供；白藜芦醇、血管紧张素Ⅱ均由美国Sigma公司提供，细胞计数试剂盒及MTT试剂盒由北京利维宁生物科技有限公司提供。

1.2 原代细胞培养及鉴定

采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMCs，在显微镜下观察细胞的生长情况，采用免疫荧光法进行细胞鉴定，以出现颗粒状绿色沉淀为阳性反应。

1.3 试验方法

选择3～5代VSMCs进行试验，制备细胞悬浊液，控制密度为5.0×107/L，接种在培养板上待用，在37℃环境下采用10%胎牛血清进行预培养24 h后分组，分为血管紧张素组 （加入1 μmol/L的血管紧张素Ⅱ进行处理）、白藜芦醇梯度组（加入10、30、100 μmol/L白藜芦醇进行处理）、联合组（加入1 μmol/L的血管紧张素Ⅱ+10、30、100 μmol/L白藜芦醇进行处理）及对照组（不做特殊处理），分别于反应0、6、12、24 h时进行检测。VSMCs在培养完成后加DMEM培养液同步化24 h，根据实验分组给予不同的处理措施，并采用含有10%胎牛血清的培养液继续培养，分别在对应时间进行细胞计数统计，重复试验3次，每次3个复孔。细胞活力检测采用MTT法，按照每孔1×103个细胞接种在96孔板上，采用培养液培养24 h并同步化，根据实验分组不同给予不同的处理措施，之后在不同时间点采用MTT法检验细胞活力，490 nm波长下测量A值，重复3次，每次6复孔。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件包对数据进行处理，计量资料用均数±标准差（）表示，组间对比采用单因素方差分析，两两对比采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 白藜芦醇对VSMCs细胞计数的影响

从各组的细胞计数结果来看，总体结果为血管紧张素组＞联合组＞白藜芦醇梯度组＞对照组，其中血管紧张素组VSMCs的细胞计数结果显著高于对照组；培养24 h时，白藜芦醇梯度组中30 μmol/L浓度下细胞计数最低（P＜0.05）；联合组中30、100 μmol/L浓度下细胞计数均显著低于10 μmol/L（P＜0.05）（表1）。

表1 各组不同时间点VSMCs细胞计数的统计（%）

 

与对照组同时间点比较，#P＜0.05；与血管紧张素组比较，*P＜0.05

2.2 白藜芦醇对VSMCs细胞活力的影响

从各组细胞活力情况来看，总体结果为血管紧张素组＞联合组＞白藜芦醇梯度组＞对照组，其中血管紧张素组VSMCs的细胞计数结果显著高于对照组；培养24 h时，同样白藜芦醇梯度组中30 μmol/L浓度下细胞计数最高（P＜0.05）；联合组中30、100 μmol/L浓度下细胞计数均显著低于10 μmol/L（P＜0.05）（表2）。

表2 各组不同时间点VSMCs细胞活力的统计（%）

 

与对照组同时间点比较，#P＜0.05；与血管紧张素组比较，*P＜0.05

动脉粥样硬化是由于动脉壁内膜的一系列细胞改变的最终结果，同时也是引发多种心脑血管疾病的重要病理基础，近年来的发生率逐渐上升，严重危害患者健康[5-6]。有流行病学调查显示，长期适量饮用葡萄酒的人群心血管疾病的发生率和死亡率均相对低于其他人群[7]，这一调查表明葡萄酒中的某些成分可能能够抑制动脉粥样硬化病变的发生发展。进一步的研究显示，葡萄酒中含量较高的白藜芦醇具有多种药理学作用，包括抗炎、抗血小板、保护心血管等[8-10]，可能是抑制动脉粥样硬化的重要原因。

主动脉VSMCs的增殖是冠状动脉硬化的基础，同时也是诱发高血压、冠心病及介入术后再狭窄等疾病的主要原因[11-13]。血管紧张素Ⅱ是一种重要的血管活性物质，能够特异性地诱导VSMCs的增殖。近年来的研究显示，抑制血管紧张素Ⅱ导致的VSMCs增殖可有效防止心血管疾病的进一步发展[14]。目前白藜芦醇用于动脉粥样硬化的防治作用已有报道，但关于白藜芦醇对血管紧张素Ⅱ诱导下的VSMCs增殖作用国内报道尚少。白藜芦醇的心血管保护作用机制涉及抑制血小板聚集和组织因子的表达、促进血管舒张、抑制脂质过氧化、抑制血管平滑肌细胞增殖等。在关于白藜芦醇与PI3K-Akt信号通路相关性的一项研究中显示，白藜芦醇预处理后，心肌组织中Bcl-2蛋白表达上调，Bax蛋白表达下调，Bax/Bcl-2下调，心肌细胞凋亡的数量显著下降[15]。同时应用白藜芦醇和渥曼青霉素时，白藜芦醇的上述作用显著减弱，这一结果提示白藜芦醇减少心肌细胞凋亡的机制可能是通过上调Bcl-2蛋白的表达，下调Bax/Bcl-2来实现的，且有PI3K-Akt信号通路的参与。此外，NO还可以通过影响缺血再灌注过程中的炎症反应过程，减少心肌细胞坏死和凋亡，而白藜芦醇能够提高心肌组织中的NO含量及活性。本次研究中通过体外实验来评估白藜芦醇对VSMCs的抑制作用，并评价了其对血管紧张素Ⅱ诱导下的VSMCs增殖的抑制效果。从研究数据来看，血管紧张素组的VSMCs细胞计数及细胞活力均随着培养时间的延长而逐渐上升，说明血管紧张素可显著地增加VSMCs细胞的增殖能力。从白藜芦醇的抑制作用来看，10 μmol/L浓度下的白藜芦醇并不能有效抑制VSMCs的增殖，而30、100 μmol/L浓度下VSMCs细胞计数及细胞活力均得到有效抑制，说明白藜芦醇具有浓度依赖性的特点。从血管紧张素Ⅱ诱导下的VSMCs增殖抑制情况来看，基本与常规抑制结果相近，同样在30、100 μmol/L浓度下能够有效控制VSM Cs的增殖。说明白藜芦醇可有效抑制血管紧张素Ⅱ诱导下的VSMCs增殖，分析原因可能与白藜芦醇的抗氧化作用有关。但由于研究时间等因素所限，本次研究中未能阐明其作用机制，尚需进一步深入研究证实。

综上所述，白藜芦醇对于血管平滑肌细胞增殖有着一定的作用，且对于血管紧张素Ⅱ所诱导的增殖有着较强的抑制效果，不同浓度下作用效果有所差异。

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Inhibitory effect study of Resveratrol on proliferation of smooth muscle cell induced by angiotensinⅡ

LI Zi-liZHANG Ruo-han
Department of Cardiovascular Medicine,Affiliated Nanhua Hospital of University of South China in Hunan Province, Hengyang 421002,China

[Abstract]ObjectiveTo explore inhibitory effect of Resveratrol on proliferation of smooth muscle cells induced by angiotensinⅡ.MethodsVascular smooth muscle cells(VSMCs)from rats were cultured in vitro.The cells were divided into angiotensin group,resveratrol gradient group,combined group and control group.The influence of resveratrol and angiotensin on proliferation of VSMCs was evaluated.The reaction on each group was lasted for 0,6,12,24 h,and proliferation of VSMCs was assessed by cell counting.The vitality of VSMCs was tested by MTT colorimetry and the results were compared and analyzed.ResultsWith regard to the results of cell counting,the general outcomes were angiotensin group, combination group,resveratrol gradient group,and control group from more to less,in which the cell counting of VSMCs in the angiotensin group was significantly higher than that in the control group (P＜0.05).In the resveratrol gradient group,the cell counting was lowest at 30 μmol/L when cultured for 24 h(P＜0.05).In the combination group,cell counting at 30 μmol/L and 100 μmol/L were greatly lower than that at 10 μmol/L(P＜0.05).Talking about cell viability,the general outcomes were angiotensin group,combination group,resveratrol gradient group,and control group from stronger to weaker.In the resveratrol gradient group,the cell counting was the highest at 30 μmol/L when cultured for 24 h (P＜0.05).In the combination group,the cell counting at 30 μmol/L and 100 μmol/L was both less than that at 10 μmol/L (P＜0.05).ConclusionResveratrol has a certain effect on proliferation of VSMCs,and has a strong inhibitory effect on proliferation induced by angiotensinⅡ.The effect differs in varied concentrations.

[Key words]Smooth muscle cell;Resveratrol;AngiotensinⅡ;Cell proliferation

[中图分类号]R965

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）01（b）-0010-03

（收稿日期：2016-12-01 本文编辑：方菊花）

[作者简介]李自立（1983-），男，湖南衡阳人，硕士，主治医师，主要研究方向：心血管内科