陈 瑾1陈晓勇1▲胡丽莎1吴小华1陈凌燕1许忠波2方 芳1

1.江西省妇幼保健院中医科，江西南昌 330006；2.江西省中医院急诊科，江西南昌 330006

[摘要]目的 探讨加味五皮饮对卵巢过度刺激综合征（OHSS）模型大鼠雌二醇（E2）、血管内皮生长因子（VEGF）和囊性纤维化跨膜转导调节器（CFTR）的影响。方法 将30只未成年雌性Wistar大鼠（SPF级）随机分为模型中药组和模型对照组，每组15只。对两组大鼠采用血清促性腺激素（PMSG）+人绒毛膜促性腺激素（HCG）的方式建立OHSS模型，同时给予加味五皮饮和生理盐水灌胃。HCG注射48 h后，沿腹部中线切开腹腔，取出大鼠双侧卵巢称重，采用免疫组化测定大鼠卵巢组织的VEGF和CFTR蛋白表达，采用RIA检测血清E2水平。结果 模型中药组的卵巢VEGF蛋白表达、CFTR蛋白水平和血清E2水平分别为 （62.20±11.71）、（57.20±19.82）、（26.91±7.63）pg/ml，模型对照组为（136.31±22.74）、（111.32±32.25）、（32.55±6.63）pg/ml，两组比较差异有统计学意义（F=69.097，P=0.01；F=67.057，P=0.01；F=16.36，P=0.01）。结论 加味五皮饮可有效降低OHSS大鼠外周血E2水平和OHSS大鼠卵巢组织中的VEGF和CFTR蛋白表达。

[关键词]卵巢过度刺激综合征；血管内皮生长因子；雌二醇

作为超促排卵药物诱发排卵治疗过程中常出现的医源性并发症综合征，卵巢过度刺激综合征（ovari anhyperstimulationsyndrome，OHSS）的发生率约为20%。其发生原因可能与卵巢中多个卵泡同时发育、血清中的E2水平过高有关，同时也可能与应用人绒毛膜促性腺激素（HCG）有关。OHSS的发生与患者体内雌、孕激素水平升高以及血管活性物质异常表达和升高相关，如与雌二醇（E2）、血管内皮生长因子（VEGF）和白介素-6（IL-6）等有关[1-2]。还有学者研究发现，在外源性促性腺激素药物作用下，体内高水平E2能导致囊性纤维化跨膜转导调节器（cystic fibrosis transmembraneconductance regulator，CFTR）异常表达于卵巢及其他组织，最终导致OHSS的发生[3-4]。本研究通过对OHSS模型大鼠造模，同时给予五皮饮加减方干预，采用免疫组化等方法观察其对模型大鼠体内 E2、VGEF、CFTR的影响，为中药在临床上预防和治疗OHSS提供理论基础，现将实验结果总结如下。

1.1实验动物

选取未成年SPF级Wistar大鼠30只（雌性），22日龄，平均体重（49.2±4.5）g，购自于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。所有大鼠在同样环境下饲养，自由饮食、饮水，相对湿度40%～60%，室温20～22℃。

1.2实验分组

采用随机数字表法将30只编号雌性Wistar大鼠分为模型中药组和模型对照组，每组15只。

1.3主要试剂与仪器

免疫组化一抗试剂（美国Santa Cruz公司）；DAB显色剂和PV-9000试剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）；IL-6检测试剂盒购于武汉优尔生；E2放免测定盒购于北京华英生物技术研究所；722型可见光分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；酶标仪（丹麦RAYTO公司）；r-911全自动放免计数仪（中国科技大学实业总公司）；高倍光学显微（德国LEICA公司）。

1.4 OHSS大鼠模型建立

按改良的Ujioka方法[2]建立OHSS模型。每只大鼠从22～25日龄连续将0.1 ml生理盐水[含10 IU血清促性腺激素（PMSG）]注入皮下，1次/d，末次注射PMSG 1 d后1次皮下注射0.1 ml生理盐水（含100 IU HCG）。

1.5中药及给药

在五皮饮基础方上加味，具体如下：白术12 g，党参12 g，桑寄生15 g，菟丝子15 g，大腹皮、桑白皮、生姜皮、茯苓皮、陈皮各20 g，黄芪12 g，当归10 g，将上述药用水中浸泡30 min，沸腾后调至小火煎煮30 min，过滤，使生药含量为1 g/ml水煎剂。于造模同时，模型中药组、模型对照组分别给予加味五皮饮和生理盐水2 ml灌胃进行干预，1次/d，连用7 d。空白组于22～26日龄皮下注射生理盐水0.1 ml，1次/d，连用5 d。人用剂量（g）×5×0.018为大鼠等效剂量，计算得1.575 g/ （100 g·d）。

1.6标本采集

在HCG注射48 h后即28日龄时，采用注射用苯巴比妥钠（80 mg/kg）麻醉30只OHSS模型大鼠，20 min后股静脉采血2 ml置于试管中，离心后-20℃保存备检；脱颈处死大鼠，沿腹部正中线切开大鼠腹腔，取出卵巢组织并称重，放入装有甲醛的PE管内固定，常规石蜡包埋、切片，用于免疫组化染色。

1.7指标测定

血清中E2测定采用放射免疫法（RIA），检测步骤按说明书操作。卵巢中VEGF和CFTR蛋白测定采用免疫组化PV二步法，应用MIQAS医学图象定量分析系统进行定量分析，每张切片中挑选5个视野，VEGF 和CFTR阳性光密度值需在相同条件下测量，切片光密度值为平均值，同时测量阳性面积，阳性面积/总面积为阳性面积比，最后算出免疫组化阳性指数。免疫组化阳性指数=阳性面积比×平均光密度值。

1.8统计学分析

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析，计量资料采用±s表示；符合正态分布及方差齐性者采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1两组E2、VEGF免疫组化阳性指数、CFTR免疫组化阳性指数的比较

模型中药组大鼠血清中的E2含量低于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型中药组的免疫组化阳性指数低于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型中药组的免疫组化阳性指数低于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 两组E2、VEGF免疫组化阳性指数、CFTR免疫组化阳性指数的比较（±s）

2.2两组的VEGF免疫组化分析

各组大鼠卵巢组织中VEGF在黄体细胞、卵泡颗粒细胞胞浆中均有表达，呈黄色（图1）。

 

图1 大鼠卵巢组织中VEGF的表达情况（免疫组化，×400）

A.模型对照组，棕黄色颗粒广泛分布；B.模型中药组，淡黄色颗粒分布减少

2.3两组的CFTR免疫组化分析

各组大鼠卵巢组织中CFTR在黄体细胞有表达，呈黄色（图2）。

 

图2 大鼠卵巢组织中CFTR的表达情况（免疫组化，×400）

A.模型对照组，棕黄色颗粒广泛分布；B.模型中药组，见少量分布淡黄色颗粒

OHSS是采用超促排卵治疗过程中常出现的医源性并发症，属于多脏器功能障碍的一种全身性疾病，其主要临床特点包括E2水平显著升高、卵巢内卵泡大量发育和体积增大等。既往研究显示，HCG在诱发卵母细胞成熟过程中具有重要作用，是超排卵治疗后诱发OHSS的先决条件[3]。其原因为HCG可诱导卵泡发育成熟和排出，增加颗粒细胞中VEGF mRNA表达，产生大量VEGF，进而增加血管通透性[4-6]。

相关报道显示，在大多数预测OHSS发生的方法中，检测患者血清中E2水平是最重要的指标之一[7]，因此E2与OHSS发生有着密切关系。有研究显示，月经期第9天患者血清E2＞800 pg/ml会增加OHSS风险[8]。也有研究显示，促排卵刺激第11天患者血清E2为3354 pg/ml时OHSS风险高达85%。如E2为3000 pg/ml且卵巢内大量卵泡增长迅速，表明易出现OHSS，需给予干预治疗[9]。血清中E2水平过高诱发OHSS机制可能与雌激素生物学效能相关，将体内E2控制至低水平有助于预防OHSS[10-12]。亦有学者指出，E2水平过高可在外源性促性腺激素作用下造成CFTR表达于卵巢及其他组织异常，导致OHSS发生，因此，不仅在促超排卵过程中会并发OHSS，同样在妊娠早期也可合并发生OHSS。有研究报道显示，妊娠可以加重OHSS症状，同时容易发生流产，但是OHSS对妊娠结局未产生明显不良影响[13-15]。

近年来，广大学者对OHSS的发生机制进行了研究，但目前西医缺乏OHSS的特效治疗方法，仅给予对症治疗，同时以预防为主。辅助生殖中心对于可能发生OHSS的患者一般采取放弃取卵周期的移植，对于已妊娠并且出现轻度OHSS的患者，一般无需特殊处理，进行门诊随访；对于已妊娠并且出现中、重度的OHSS的患者，则需收入院治疗，监测患者24 h的出入量，主要纠正血容量及水电解质紊乱，保护肝肾功能，同时防止因血液浓缩导致的血栓的形成，减少血管内液体渗出，预防发生低血容量性休克。未妊娠的患者一般不会发生OHSS，即使发生也会很轻，不用特殊处理。

OHSS是现代医学发展后产生的医源性并发疾病，传统医学未对OHSS进行阐述，但其全身水肿、腹及胸腔积液、双侧卵巢增大等临床症状和体征与中医学理论中的癥瘕、臌胀、子肿等疾病相关，因此归于上述疾病范畴[16]。中医理论认为，其病变与肝、肾、脾、肺等脏器密切相关[17-18]。五皮饮方收载于华佗的《华氏中藏经》，组方包括广陈皮、茯苓皮、大腹皮、桑白皮、姜皮，常用于治疗妊娠水肿和皮水。方中陈橘皮化湿浊、和胃气，大腹皮消胀满、行水气，桑白皮调水道、调水道，生姜皮散水饮，茯苓皮补脾运化、利水渗湿，上述诸药共奏利气健脾、利湿消肿功效。在上述方上加味党参、当归、白术、黄芪、桑寄生、菟丝子，可发挥利湿消肿、理气健脾作用。本研究结果显示，加味五皮饮能够有效抑制OHSS模型大鼠血清中的E2、IL-6水平，降低腹腔毛细血管通透性和VEGF蛋白在卵巢中的表达，从而对OHSS的发生起到防治作用。

综上所述，本次研究为临床上采用中药加味五皮饮防治OHSS奠定了一定的理论基础，能够更好地指导临床用药，值得推广应用。

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Influence study of Jiawei Wupi Decoction on E2,VEGF and CFTR of ovarian hyperstimulation syndrome model rats

CHEN Jin1CHEN Xiao-yong1▲HU Li-sha1WU Xiao-hua1CHEN Ling-yan1XU Zhong-bo2FANG Fang1
1.Departmentof Traditional Chinese Medicine,Maternal and Child Health Care Hospital of Jiangxi Province,Nanchang 330006,China;2.Department of Emergency,Hospital of Traditional Chinese Medicine of Jiangxi Province,Nanchang 330006,China

[Abstract]ObjectiveTo explore the influence of Jiawei Wupi Decoction on E2,VEGF and CFTR in rats with ovarian hyperstimulation syndrome (OHSS).Methods30 female Wistar rats(SPF grade)were randomly divided into the model traditional Chinese medicine group and the model control group,15 cases in each group.PMSG+HCG way were used on the rats of two groups to establish OHSS model,at the same time,Jiawei Wupi Decoction and normal saline were given. After 48 h of HCG injection,the abdominal cavity was cut along the midline of abdomen and the ovaries were weighed. The expression of VEGF and CFTR protein in the ovary of rats were detected by immunohistochemistry.Neutral serum E2level was detected by RIA.ResultsThe expression of VEGF protein,CFTR protein and serum E2in model traditional Chinese medicine group were (62.20±11.71),(57.20±19.82),(26.91±7.63)pg/ml，the model control group were (136.31± 22.74),(111.32±32.25),(32.55±6.63)pg/ml，the difference was statistically significant(F=69.097,P=0.01;F=67.057,P=0.01; F=16.36,P=0.01).ConclusionJiawei Wupi Decoction can effectively decrease the level of E2in OHSS rats and the expression of VEGF and CFTR protein in ovarian tissues of OHSS rats.

[Key words]Ovarian hyperstimulation syndrome;Vascular endothelial growth factor;Estradiol

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2016）12（c）-0008-04

（收稿日期：2016-10-17本文编辑：祁海文）

[基金项目]江西省青年科学基金资助项目（20132BAB215036）

[作者简介]陈瑾（1977-），女，博士，研究方向：中医妇科

▲通讯作者：陈晓勇（1967-），男，硕士，研究方向：妇科内分泌