陈 烨 邹聪华 郑晓春

福建省立医院麻醉科，福建福州 350000

[摘要]目的探讨鞘内注射艾司洛尔对甲醛炎性大鼠脊髓背角COX-2 mRNA表达的影响。方法鞘内置管后，36只SD大鼠采用随机数学表法分为3组（n=12）：生理盐水组（N组），300 μg/kg（S1组），600 μg/kg（S2组）。鞘内置管5 d后，注射以上各组药物，然后在大鼠后肢皮下注射甲醛50 μl，以Von-Frey细丝法和Hargreaves法测定机械缩足反射阈值（MWT）和热刺激缩足反射潜伏期（TWL），观察大鼠的疼痛行为学变化。观察1.5 h后，采用RTPCR方法观察脊髓背角L4～5COX-2 mRNA表达。结果与N组比较，S1、S2组的Ⅱ相阶段的疼痛行为均有所减少，且S1、S2组L4～5节段脊髓表达的COX-2 mRNA的量均比N组少（P＜0.01）。结论鞘内注射艾司洛尔可减少甲醛大鼠脊髓背角COX-2 mRNA表达。

[关键词]疼痛；脊髓；艾司洛尔；环氧化酶-2

肾上腺素受体分布于大部分交感神经节后纤维所支配的效应器细胞膜上，其受体分为3种类型，即β1受体、β2受体和 β3受体。β1受体主要分布于心肌，可激动引起心率和心肌收缩力增加，其代表为艾司洛尔，近几年被广泛应用于临床。有研究发现该阻滞药可减少麻醉维持药物的用量[1-4]，而静脉注射艾司洛尔可减少丙泊芬的注射痛[5]，但β1受体阻滞药艾司洛尔是否具有调节疼痛的作用仍未阐明。环氧化酶（COX）是前列腺素合成的一个重要限速酶，在体内存在2种形式：COX-1和COX-2，而COX-2/PG通路参与伤害性疼痛在脊髓水平的传递。本研究拟通过鞘内注射艾司洛尔，观察大鼠脊髓背角COX-2 mRNA表达的变化，来探索艾司洛尔是否具有疼痛调节作用。

1.1 试剂与仪器

Microspianl导管（美国ALZA公司），盐酸艾司洛尔注射液（山东齐鲁制药厂，批号20130232），5%甲醛（生理盐水3.2 ml+37%甲醛0.5 ml），real time PCR仪（TAKARA公司，日本）MMLV逆转录试剂盒、PCR试剂盒（Invitrogen Life公司，美国）。

1.2 鞘内置管

SD雄性大鼠，由福建医科大学实验动物中心提供，体重260～290 g。用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射，参照方法[5]，鞘内置管。置管隔天行注射2%利多卡因实验，未出现双下肢无力的大鼠剔除。

1.3 实验分组

将置管成功大鼠随机分为3组（n=12）：生理盐水组（N组），艾司洛尔300 μg/kg组（S1组），艾司洛尔600 μg/kg组（S2组）。置管后5 d，大鼠注射各组药物后在同侧足掌皮下注射5%甲醛50 μl。

1.4 炎性疼痛大鼠的制备

置管后5 d，所有大鼠注射药物后均在一侧足掌皮下注射5%甲醛50 μl。

1.5 疼痛行为的观察

以Von-Frey细丝法[5]和Hargreaves法[6]测定机械缩足反射阈值 （MWT）和热刺激缩足反射潜伏期（TWL），观察大鼠术后2 h的疼痛行为学变化。每只大鼠测定5次，每次间隔3 min，取平均值。注入甲醛后3组大鼠继续存活1.5 h。

1.6 RT-PCR检测COX-2 mRNA表达

大鼠均在注射甲醛后1.5 h断头处死，剪开脊柱肌肉及椎板，暴露脊髓和L5神经节，截取L4～5段脊髓。以Trizol（Gibco公司）一步法提取脊髓组织总RNA。取1 μg总RNA用RT-PCR kit（Takara）进行逆转录，取逆转录产物5 μl为模板，进行PCR扩增，COX-2引物上游序列：5′-ACACTCTATCACTGGCATCC-3′，下游序列：5′-GAAGGGACACCCTTTCACAT-3′，扩增片段长度为584 bp；内参照β-actin上游序列5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′，下游序列5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，扩增片段长度为265 bp，由宝生物工程公司合成。循环条件为94℃60 s，56℃90 s，72℃90 s，共30个循环。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，以UVP计算机图像扫描分析系统测定电泳条带密度值，以β-actin为内参照，计算COX-2 mRNA的相对含量，以COX-2条带密度与β-actin条带密度比值反应COX-2 mRNA表达。

1.7 统计学方法

数据采用SPSS 15.0软件进行统计学处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 各组疼痛行为学的比较

NS组、S1组、S2组注射甲醛后出现疼痛反应，表现为注射足只能稍受力或不能受力，抬起甚至舔咬注射足。与N组相比，S1、S2组MWT均降低，TWL缩短（P＜0.01）（表1）。

表1 三组注射甲醛不同时段MWT和TWL的比较（n=12，±s）

 

与N组比较，*P＜0.01；与S1组比较，△P＜0.01

2.2 RT-PCR结果

S1、S2组电泳条带明显变暗，与β-actin条带密度比值变小，大鼠L5脊髓的COX-2 mRNA的表达均下降（P＜0.01）（表2）。

表2 三组大鼠不同时点脊髓COX-2 mRNA表达的比较（n=8，±s）

 

与N组比较，*P＜0.01；与S1组比较，△P＜0.01

急慢炎性疼痛实验中，甲醛实验是具有代表性的模型[7-8]，被广泛应用于疼痛相关机制及止痛药的评价。有研究表明，大鼠后足注射甲醛后即可出现2个疼痛机制不同的反应时相：Ⅰ相（5～10 min）是甲醛直接刺激外周伤害感受器所致；Ⅱ相（15～50 min）是主要是由于中枢神经系统神经元兴奋性增加而导致中枢敏化有关[9-10]。本研究中N组大鼠足底注射甲醛后，大鼠出现明显的两相疼痛反应，表明大鼠出现了炎性疼痛及痛觉过敏，Ⅱ相N组的时间显著高于S1、S2组，提示艾司洛尔能抑制炎性反应所导致的第二期的疼痛中枢敏感化，这可能与艾司洛尔抑制交感神经有关。

本研究检测的COX-2正常情况下在脊髓表达水平很低或无，当外周受疼痛刺激时，脊髓背角浅层神经元中COX-2 mRNA将迅速增加，在2 h达到高峰。脊髓背角浅层（Ⅰ、Ⅱ板层）是接收躯体伤害性信息的初级处理中心和对伤害信息反应的重要部位，而COX-2表达的上调在脊髓背角分布脊髓处理伤害性感受的区域相一致[11]。故可认为COX-2在伤害性信息的传递中发挥着重要的作用。本研究中甲醛致炎后的大鼠脊髓背角均可见高表达的COX-2，说明存在伤害性刺激的持续性传入。这是由于局部分泌大量的炎性因子如TNF-α、IL-1、IL-6等，这些致炎物质在神经根周围形成“炎症汤”，持续刺激神经产生异位放电，不断轰击脊髓背角，从而使COX-2通路处于长期激活状态[12-13]。

本研究表明，艾司洛尔呈剂量依赖地减少甲醛炎性大鼠Ⅱ相的疼痛行为，并且抑制了脊髓背角COX-2 mRNA表达。Satoshi发现兰地洛尔可减少甲醛炎性大鼠脊髓c-fos mRNA表达[14]，也表明了β1受体阻滞剂具有减少炎性疼痛的作用。有研究发现β1受体阻滞剂阻滞感觉神经中的河豚毒素相关的Na+离子通道[15-16]，他发现β-受体阻滞剂能激活游离细胞膜上的G-蛋白，产生突触后或突触前抑制，减少神经介质的释放，提示β-受体阻滞剂对疼痛有中枢抑制作用，虽然艾司洛尔脂溶性低、在血液中被快速代谢，但并不排除其具有中枢作用的可能性。本研究采用置管给药，理论上存在局部吸入血引起全身效应，但艾司洛尔是超短效药，不可能持续存在几个小时的镇痛作用，所以推断艾司洛尔在脊髓水平参与了疼痛的调节。虽然鞘内单独应用艾司洛尔的镇痛效应不足以完全逆转痛行为，但其独特的抗损伤效应和累积的镇痛效应，可能使其成为新的鞘内镇痛的辅助用药。由于国内外对艾司洛尔调节疼痛研究少，其机制仍需进一步研究并阐明。

[1]李彩虹.气管表面麻醉与静注艾司洛尔对全麻诱导插管时血流动力学的影响[J].临床麻醉学杂志，2009，25（4）：1072-1073.

[2]Lee MH，Chung MH，Han CS，et al.Comparison of effects of intraoperative esmolol and ketamine infusion on acute postoperative pain after remifentanil-based anesthesia in patients undergoing laparoscopic cholecystectomy[J].Korean J Anesthesiol，2014，66（3）：222-224.

[3]腾士勇，陶国荣，于布为.艾司洛尔、拉贝洛尔和尼卡地平对气管插管期间心血管反应、脑电双频指数和熵指数的影响[J].临床麻醉学杂志，2008，9（3）：756-758.

[4]Akgün Salman E，Titiz L，Akpek E，et al.Pretreatment with a very low dose of intravenous esmolol reduces propofol injection pain[J].Agri，2013，25（1）：13-18.

[5]Dhir R，Singh MR，Kaul TK.Effect of intravenous esmolol on analgesic requirements in laparoscopic cholecystectomy[J]. Anaesthesiol Clin Pharmacol，2015，31（3）：37-39.

[6]Yaksh TL，Rudy TA.Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space[J].Physiol Behav，1976，17（1）：1031-1036.

[7]Davidson EM，Doursout MF，Szmuk P，et al.Antinociceptive and cardiovascular properties of esmolol following formalin injection in rats[J].Can J Anesth，2001，48（1）：59-64.

[8]Onifer SM，Reed WR，Sozio RS，et al.Antinociceptive effects of spinal manipulative therapy on nociceptive behavior of adult rats during the formalin test[J].Evid Based Complement Alternat Med，2015，2015：520454.

[9]Diniz DA，Petrocchi JA，Navarro LC.Serotonin induces peripheral mechanical antihyperalgesic effects in mice[J].Eur J Pharmacol，2015，15（2）：767-769.

[10]Hagihrra S，Taesaka N，Yoshiya I.Inhalation anesthetics sμppress the expression of c-Fos protein evoked by noxioμs somatic stimulation in the deeper of the spinal cord in the rat[J].Brain Res，1997，751（1）：124-130.

[11]Hunter D，Chai C，Barr GA.Effects of COX inhibition and LPS on formalin induced pain in the infant rat[J].Dev Neurobiol，2015，75（10）：1068-1079.

[12]Louati K，Berenbaum F.Fatigue in chronic inflammation-a link to pain pathways[J].Arthritis Res Ther，2015，17（2）：254-256.

[13]Ji RR，Gereau RW 4th，Malcangio M，et al.MAP kinase and pain[J].Brain Res Rev，2009，60（1）：135-148.

[14]Mizobuchi S，Matsuoka Y，Obata N，et al.Antinociceptive effects of intrathecal landiolol injection in a rat formalin pain model[J].Acta Med Okayama，2012，66（3）：285-289.

[15]Gencer A，Gunduz O，Ulugol A.Involvement of descending serotonergic and noradrenergic systems and their spinal receptor subtypes in the antinociceptive effect of dipyrone[J]. Drug Res（Stuttg），2015，65（12）：645-649.

[16]Hageluken A，Naurnberg B，Harhammer R，et al.Lipophilic beta-adrenoceptor antagonists are effective direct activators of G-proteins[J].Biochem Pharmacol，1994，47（10）：1789-1795.

Effect of Esmolol on the expression of COX-2 mRNA in spinal cord of inflammatory rats

CHEN Ye ZOU Cong-hua ZHENG Xiao-chun
Department of Anesthesiology,Fujian Provincial Hospital,Fuzhou 350000,China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of intrathecal injection of Esmolol on the expression of COX-2 mRNA in the spinal dorsal horn of formaldehyde-induced inflammatory rats.MethodsAfter the intrathecal catheterization,36 SD rats were randomly divided into 3 groups (n=12):saline group (group N),300 μg/kg group (group S1),and 600 μg/kg group (group S2).5 days after the intrathecal catheterization,the drug of each group was given to the rats respectively and then 50 μl formaldehyde was injected subcutaneously in the hind limbs of rats.Von-Frey method and Hargreaves method were adopted to measure the mechanical withdrawal threshold(MWT)and thermal withdrawal latency(TWL)so as to observe the pain behavioral changes in rats.After 1.5 hours observation,RT-PCR was given to observe COX-2 mRNA expression in L4～5spinal dorsal horn.ResultsCompared with group N,phase II pain behaviors in group S1 and group S2 were reduced and the expression of COX-2 mRNA in L4～5spinal dorsal horn in group S1 and group S2 was less than that in group N (P＜0.01).ConclusionIntrathecal injection of Esmolol reduces COX-2 mRNA expression in the spinal dorsal horn of formalin-induced rats.

[Key words]Pain;Spinal cord;Esmolol;Cyclooxygenase 2

[中图分类号]R332

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2016）12（b）-0135-03

（收稿日期：2016-10-28 本文编辑：许俊琴）

[作者简介]陈烨（1982-），主治医师，研究方向：麻醉与疼痛