张美玲 陈彦杰▲赵 亭 褚银铃 张 洁 房 艳 贾德贤

新奥集团新绎健康科技有限公司，河北廊坊 065001

[摘要]目的建立高效液相色谱同时测定“改善睡眠颗粒”中天麻素、红景天苷、栀子苷和斯皮诺素含量的方法。方法检测对象为以上提到的“改善睡眠颗粒”中的四个主要成分。采用的色谱柱为Thermo Fisher Syncronis C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水，梯度洗脱，流速为1.0 ml/min；柱温为30℃，进样量为10 μl。检测波长分别设定为220、238、275、335 nm。结果天麻素、红景天苷、栀子苷和斯皮诺素分别在0.8032～4.0160、0.5392～2.6960、2.6916～13.4580、0.2112～1.0560 μg范围内线性关系良好；精密度、稳定性、重复性试验的均RSD＜2.00%；加样回收率分别为98.17%、99.37%、98.84%、99.27%；RSD分别为0.67%、0.48%、0.49%、0.93%。结论高效液相色谱法可同时测定“改善睡眠颗粒”中天麻素、红景天苷、栀子苷和斯皮诺素的含量，且该方法简便、准确，可用于该制剂的质量控制。

[关键词]改善睡眠颗粒；高效液相色谱；天麻素；红景天苷；栀子苷；斯皮诺素

睡眠对人是必不可少的休息方式，通过睡眠使疲劳的神经细胞恢复正常的生理功能，精神和体力得到恢复。然而，随着社会的快速发展及生存环境的变化，具有睡眠方面障碍的人数量越来越多。睡眠障碍严重影响着人们的身心健康、生活质量和工作效率。“改善睡眠颗粒”由天麻、酸枣仁、红景天及栀子等中药组成，是新绎健康科技有限公司依据临床经验方加减，开发为具有改善睡眠作用的保健食品。方中天麻为君药，酸枣仁为臣药，天麻具有镇静催眠、镇痛、益智等作用[1]，天麻素是天麻的主要成分，具有多种药理作用，包括神经衰弱综合症、阿尔茨海默病综合症、帕金森病等[2-4]。酸枣仁具有镇静催眠、镇痛、抗血小板聚集等作用[5-6]。斯皮诺素为黄酮碳苷类成分，是酸枣仁主要成分之一，现代药理研究表明能显著增强戊巴比妥诱导的睡眠，表现在睡眠时间增加和睡眠潜伏期减少，其作用机制可能与拮抗5-HT（1A）受体有关[7-8]。藏药红景天是我国珍贵的药材，享有“高原人参”的美誉，红景天除用于治疗高原反应，近年研究表明具有抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、治疗心血管疾病及神经系统疾病等[9]，主要成分红景天苷是研究的热点，已报道的药理作用有抗疲劳、抗衰老、免疫调节、清除自由基、增强记忆、改善睡眠等[10-11]。栀子为药食两用的物品，不仅在中医临床中经常使用，在食品与保健食品中也应用广泛，现代药理研究表明，栀子具有保肝利胆、降压、镇痛、镇静等作用[12]，其主要活性成分是栀子苷和栀子黄色素，栀子苷也呈现多种药理作用[13]。基于以上分析，本实验采用HPLC方法同时测定“改善睡眠颗粒”中天麻素、红景天苷、栀子苷及斯皮诺素四个主要成分的含量，可以较好的反应该制剂的作用物质基础，为其质量控制研究提供参考。

1.1 仪器和设备

Thermo Ultimate 3000双三元高效液相色谱仪[（DGLC），美国赛默飞世尔公司]；十万分之一分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ250DB型超声波清洗仪（昆山市超声波仪器有限责任公司）。

1.2 药品与试剂

“改善睡眠颗粒”及其提取物中间体均为新奥集团新绎健康科技有限公司提供。天麻素、红景天苷、栀子苷、斯皮诺素对照品均购自于北京欣荣科技有限公司（批号分别为150708、150619、150612、150807）。乙腈为色谱纯，水为高纯水；除另有规定外，其余试剂均为分析纯。

2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Fisher Syncronis C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈（A）-水（B）为流动相，洗脱梯度为0～3 min，6%A；3～13 min，6%～18%A；13～22 min，18%～40%A；22～23 min，40%～6%A；23～30 min，6%A。流速1.0 ml/min，柱温25℃，进样量10 μl。按上述色谱条件，各成分分离度良好，测定结果见图1和图2。

 

图1 混合对照品的高效液相色谱图（220 nm）

 

图2 改善睡眠颗粒高效液相色谱图（220 nm）

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取对照品适量，置入10 ml量瓶中，用甲醇溶解定容，配制浓度分别为天麻素200.8 μg/ml、红景天苷134.8 μg/ml、栀子苷672.9 μg/ml、斯皮诺素52.8 μg/ml的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取“改善睡眠颗粒”提取物中间体及小试颗粒各0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25 ml，称定重量，超声处理（功率100 W，频率45 kHz）40 min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液4、8、12、16、20 μl注入高效液相色谱仪，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录各成分峰面积。以进样量（μg）为横坐标（x），峰面积值为纵坐标（y）进行线性回归，得各成分的回归方程（表1）。

表1 天麻素、红景天苷、栀子苷、斯皮诺素的标准曲线方程

2.4 精密度试验

取“2.1”项下制备的混合对照品溶液，连续测定6次，记录各成分峰面积。结果，天麻素、红景天苷、栀子苷和斯皮诺素峰面积的 RSD分别为 0.50%、0.23%、0.20%和0.23%，表明仪器的精密度良好。

2.5 稳定性试验

精密吸取“2.2”项下制备的样品溶液各20 μl，分别在配置后0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录各成分峰面积。结果表明天麻素、红景天苷、栀子苷和斯皮诺素峰面积的 RSD分别为 1.94%、0.59%、0.75%和1.64%，表明对照品溶液和供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验

取同一批小试颗粒样品6份，按“2.2”项下方法操作制备供试品溶液，进样测定，记录各成分峰面积，结果表明天麻素、红景天苷、栀子苷和斯皮诺素峰面积的RSD分别为0.70%、0.45%、0.67%和1.48%，表明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称取同法测定的已知含量小试颗粒样品共6份，分别精密加入混合对照品适量，按“2.2”项下的方法制备样品溶液，记录各成分峰面积，经计算结果如表2，回收率在98.0%～99.5%，表明本法准确度较好。

表2 加样回收率试验结果（n=6）

2.8 样品含量的测定

取一批小试颗粒和四种提取工艺下的提取物中间体。按“2.2.2”项下进行溶液制备，平行制备3份。按“2.2.1”项下的色谱条件进行测定，记录峰面积并计算含量，结果见表3。

表3 不同工艺提取物中间体及改善睡眠颗粒中各成分的含量（n=3）

本实验确定的方法同时测定样品（四种工艺下制备的复方提取物及小试颗粒样本）中天麻素、红景天苷、栀子苷及斯皮诺素的含量进行了测定，四种成分都能检出，并且能够完全分离，说明此法可以指导提取工艺的优化及样品的质量控制。

3.1 提取溶剂的选择

供试品制备过程中，根据指标性成分的性质，选择甲醇、60%甲醇、30%甲醇和水为提取溶剂，超声提取40 min，发现甲醇浓度越高不溶物越多。水为溶剂时提取溶液较澄清，各成分能达到有效分离，且各成分的提取率最高，故最终选择水作为提取溶剂。

3.2 检测波长的选择

根据《中国药典》2015年版天麻、栀子、红景天和酸枣仁项下的规定，天麻素、红景天苷、栀子苷和斯皮诺素的最大吸收波长分别为220、238、275、335 nm[14]，因此，分别在以上波长下积分计算峰面积，保证结果的准确性。

3.3 流动相的选择

天麻素、栀子苷、红景天苷和斯皮诺素在《中国药典》2015年版中各成分测定的色谱条件中流动相除红景天苷使用甲醇-水外，其余都是乙腈-水；水相只有测定天麻素时是0.05%磷酸水溶液，同时也参考了文献报道的液相条件[15-18]，确定本实验中同时测定这四种成分含量的流动相为乙腈-水。经过摸索确定适合的洗脱程序，各成分峰型良好，且分离度均＞1.5。本文确定的同时测定“改善睡眠颗粒”中天麻素、红景天苷、栀子苷及斯皮诺素含量的HPLC方法，样品制备方法简单，分离效果良好，专属性强、精密度高、重复性较好，为提取工艺的确定提供依据，为“改善睡眠颗粒”质量标准的制定提供参考。

[1]刘剑，闫建坤.天麻素氯化钠注射液的质量标准研究[J].中国当代医药，2014，21（30）：8-11.

[2]陈贵生.天麻素药理作用研究进展[J].中国药物经济学，2015，（S1）：281-283.

[3]龚其海，石京山，杨丹莉，等.天麻素在中枢神经系统药理作用及其机制[J].中药新药与临床杂志，2011，30（3）：176-179.

[4]李红月，孙志伟，王淑琴.天麻素在神经系统的药理作用研究概况[J].中国医院药学杂志，2015，35（11）：1047-1050.

[5]马进杰，刘萍，马百平.酸枣仁化学成分及其镇静催眠作用研究进展[J].国际药学研究杂志，2011，38（3）：206-211.

[6]陈雯，黄世敬.酸枣仁化学成分及药理作用研究进展[J].时珍国医国药，2011，22（7）：1726-1728.

[7]Wang LE，Bai YJ，Shi XR，et al.Spinosin，a C-glycoside flavonoid from semen Zizhiphi Spinozae，potentiated pentobarbital-induced sleep via the serotonergic system[J].Pharmacol Biochem Behav，2008，90（3）：399-403.

[8]Wang LE，Cui XY，Cui SY，et al.Potentiatingeffectof spinosin，a C-glycoside flavonoid of Semen Ziziphi spinosae，on pentobarbital-induced sleep may be related to postsynaptic 5-HT（1A）receptors[J].Phytomedicine，2010，17（6）：404-409.

[9]孙健，李克明.红景天药理研究和临床作用[J].中医临床研究，2016，8（6）：144-146.

[10]Wu WY，Hou JJ，Long HL，et al.TCM-based new drug discovery and development in China[J].Chin J Nat Med，2014，12（4）：241-250.

[11]刘志会.红景天苷药理作用及机制[J].天津药学，2016，28 （2）：67-69.

[12]牧丹，苏日那，格根塔娜，等.栀子的化学成分与药理作用研究[J].中国疗养医学，2015，24（1）：34-36.

[13]王恩力，董方，姚景春.栀子苷药理学和毒理学研究进展[J].中国药房，2015，26（19）：2730-2733.

[14]国家药典委员会.中国药典[M].一部.北京：中国医药科技出版社，2015：58，154，248，366.

[15]章运典，周里欣，陈洪英.RP-HPLC法同时测定天智颗粒中天麻素、栀子苷、芦丁和黄芩苷[J].中成药，2014，6 （8）：1670-1673.

[16]臧文怡，毛春芹，苏晓楠，等.HPLC同时测定益经颗粒中芍药苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷和斯皮诺素的含量[J].中国实验方剂学杂志，2016，22（5）：60-63.

[17]祝洪艳，张力娜，唐姗，等.HPLC法测定3个产地酸枣仁中斯皮诺素和酸枣仁皂苷A、B的含量[J].药物分析杂志，2015，35（12）：2099-2104.

[18]师永清，康淑荷，王爱军.HPLC法同时测定导赤丸中栀子苷、芍药苷、黄芩苷和盐酸小檗碱[J].中成药，2013，35 （7）：1462-1465.

The application of simultaneous determination of Gastordine,Salidroside, Geniposide and Spinosin in“Gaishanshuimian Granules”by HPLC

ZHANG Mei-ling CHEN Yan-jie▲ZHAO Ting CHU Yin-ling ZHANG Jie FANG Yan JIA De-xian
Ovation Health Science and Technology Co.Ltd.,ENN Group,Langfang 065001,China

[Abstract]ObjectiveTo establish an HPLC method for simultaneous determination of four constituents(Gastordine, Salidroside,Geniposide,Spinosin)in“GaishanshuimianGranules”.MethodsAforementionedfourmajorconstituentsin“Gaishanshuimian Granules”as the detecting subject.Column was Thermo Fisher Syncronis C18(250 mm×4.6 mm,5 μm).Mobile phase was acetonitrile-water,gradient elute,flow rate was 1.0 ml/min.Column temperature was maintained at 30℃, sample size was 10 μl.Detection wavelengths were set at 220,238,275 and 335 nm.ResultsLinear range of Gastordine, Salidroside,Geniposide,and Spinosin respectively were 0.8032-4.0160,0.5392-2.6960,2.6916-13.4580,0.2112-1.0560 μg. The RSD of precision,stability and repeatability test were all less than 2.00%.The average recoveries respectively were 98.17%,99.37%,98.84%and 99.27%with RSD of 0.67%,0.48%,0.49%and 0.93%,respectively.ConclusionThis developed HPLC method is reliable and convenient for simultaneous determination of Gastordine,Salidroside,Geniposide, and Spinosin,which could be applied to determine contents of four constituents and quality control of"Gaishanshuimian Granules".

[Key words]Gaishanshuimian Granules;HPLC;Gastordine;Salidroside;Geniposide;Spinosin

[中图分类号]R927.2

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2016）12（b）-0011-04

（收稿日期：2016-11-07 本文编辑：顾雪菲）

[作者简介]张美玲（1990-），女，硕士研究生，从事中药物质研究

▲通讯作者：陈彦杰（1984-），女，助理工程师，从事中草药分析工作