张春节1姜维美2韩 磊1孙咏梅1▲

1.江苏省连云港市第二人民医院病理科，江苏连云港 222000；2.江苏省连云港市第二人民医院肿瘤科，江苏连云港 222000

[摘要]目的探讨ERCC1、β-tubulin 3及TOPOⅡ在晚期非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达与临床病理特征及与铂类化疗疗效的关系。方法选取2012年1月～2013年6月在我院治疗的61例晚期NSCLC住院患者作为研究对象，采用免疫组化方法检测其组织中ERCC1、β-tubulin 3及TOPOⅡ的表达，患者均接受培美曲塞联合奈达铂方案化疗并定期评价疗效。结果ERCC1、β-tubulin 3的表达与患者的年龄、性别、临床分期及组织学类型均无关（P＞0.05）；TOPOⅡ的表达与患者的年龄、性别、临床分期无关（P＞0.05）；TOPOⅡ在腺癌中阳性表达8例（22.86%），鳞癌阳性表达14例（53.85%），鳞癌的表达高于腺癌，差异有统计学意义（P=0.017）。ERCC1、β-tubulin 3及TOPOⅡ的阳性表达分别为40.98%（25/61）、47.54%（29/61）及36.66%（22/61），阳性表达化疗有效率分别为16.00%（4/25）、48.28%（14/29）及63.64%（14/22），阴性表达化疗有效率分别为63.89%（23/36）、40.63%（13/32）及33.33%（13/39）。结论ERCCI及TOPOⅡ阳性可预测NSCLC对铂类化疗药物的疗效，且TOPOⅡ对不同组织学类型的晚期非小细胞肺癌疗效预测具有重要意义。

[关键词]非小细胞肺癌；ERCC1；β-tubulin 3；TOPOⅡ；免疫组化

目前，肺癌是导致全球肿瘤患者死亡的最主要原因，其中80%～85%为非小细胞肺癌 （non-small cell lung cancer，NSCLC），手术是Ⅰ～Ⅱ期及部分ⅢA期NSCLC患者的主要治疗方法之一，虽术后给予辅助化疗，但生存率改善不佳，有研究显示，其5年生存率较前仅改善5%左右[1-2]。临床中，约3/4的患者确诊时已是晚期，失去了手术机会，主要的治疗手段为化疗[3]。近年来，以铂类为基础的第三代联合化疗方案是NSCLC一线治疗的金标准，但肿瘤细胞对其的耐药性仍很高，往往导致治疗失败。随着对功能性基因组研究的深入，近年来，切除修复交叉互补基因1（excision repair cross-completion 1，ERCC1）在铂类耐药中的作用日益受到重视，β-微管蛋白3（β-tubulin 3）的表达与紫杉类耐药密切相关[4]，而国外有学者报道其表达与铂类耐药也存在相关性。近十年来，拓扑异构酶Ⅱ（toposiomerase-Ⅱ，TOPOⅡ）也被视为一种新的耐药相关基因，被认为是化疗失败的原因之一。本研究采用免疫组化方法检测分析NSCLC患者组织ERCC1、β-tubulin 3及TOPOⅡ的表达情况，探讨ERCC1、β-tubulin 3及TOPOⅡ的表达与铂类疗效的关系，为基因检测在肿瘤个体化治疗中的应用提供一定的理论基础。

1.1 一般资料

选取2012年1月～2013年6月在我院治疗的61例住院患者作为研究对象，所有患者均通过病理确诊为NSCLC，均为初诊治疗。其中男性45例，女性16例；年龄46～75岁，中位年龄60岁；鳞癌26例，腺癌35例；ⅢB期29例，Ⅳ期32例；体力状况（PS）评分≤2分；治疗前肝肾功能、血常规及心电图均正常；预计生存时间≥3个月；有可测量的临床指标（CT、MIR等）。患者均接受培美曲塞联合奈达铂方案化疗4～6个周期，每2个周期评价疗效。

1.2 化疗方案及所用试剂

培美曲塞：第1天给药，500 mg/m2，溶于100 ml生理盐水稀释后，静脉滴注10 min；奈达铂第2天给药，60 mg/m2，溶于500 ml生理盐水稀释后，静脉滴注，滴注时间＞1 h，滴完后继续输液1000 ml；给化疗药之前常规给予5-HT3受体阻断剂阿扎司琼10 mg静脉滴注以镇吐，21 d为1个周期。治疗2个周期。主要试剂：鼠抗人ERCC1单克隆抗体，鼠抗人β-tubulin 3单克隆抗体，鼠抗人TOPOⅡ单克隆抗体，即用型免疫组织化学超敏SP试剂盒（KIT-9701）及DAB染色液（KIT-0017），均购自福建迈新生物技术有限公司。

1.3 观察指标及评价标准

观察2周后参照实体瘤疗效评判标准进行疗效评价，具体如下。完全缓解（CR）：部病灶消失维持4周，无新病灶出现；部分缓解（PR）：缩小≥30%维持4周，无新病灶出现；疾病稳定（SD）：病灶既未缩小≥30%并维持4周也未增加≥20%或出现新病灶。

免疫组化染色：组织蜡块3 μm切片行免疫组化，ERCC1和TOPOⅡ均阳性表达于细胞核，β-tubulin 3阳性表达于细胞质，以出现棕黄色颗粒为阳性标志。结果判定：采用随机双盲法阅片，高倍视野下随机选取计数200个肿瘤细胞，观察阳性细胞百分比及阳性染色强度，然后进行评分。细胞计数评分标准：阳性细胞数＜10%为0分，10%～25%为1分，＞25%～75%为2分，＞75%为3分。染色强度评分标准：着色部位不着色为0分，着色部位着色不全为1分，着色部位完全着色且淡染为2分，着色部位完全着色且深染为3分。两方面评分相加0～3分为低表达（-），4～6分为阳性表达（+）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行处理，各组间计数资料的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 ERCC1、β-tubulin 3及TOPOⅡ在晚期NSCLC组织中的表达

在61例NSCLC中，ERCC1阳性表达25例（40.98%），β-tubulin 3阳性表达29例（47.54%），TOPOⅡ阳性表达22例（36.66%）。

2.2 ERCC1、β-tubulin 3及TOPOⅡ的表达与临床病理特征的关系

ERCC1、β-tubulin 3的表达与患者的年龄、性别、临床分期及组织学类型均无关（P＞0.05），TOPOⅡ的表达与患者的年龄、性别、临床分期无关（P＞0.05）。TOPOⅡ在腺癌中阳性表达8例（22.86%），在鳞癌中阳性表达14例（53.85%），在鳞癌中的表达高于腺癌，差异有统计学意义（P=0.017）（表1）。

表1 ERCC1、β-tubulin 3及TOPOⅡ的表达与临床病理特征的关系（n）

 

“*”表示中阳性表达（++～+++）；“**”表示阴性及无表达（-～+）

2.3 ERCC1、β-tubulin 3及TOPOⅡ的表达与铂类化疗疗效的关系

ERCC1阳性表达患者化疗有效率为16.00%（4/ 25），非阳性表达患者化疗有效率为63.89%（23/36），差异有显著性 （P=0.000）；β-tubulin 3阳性表达患者的化疗有效率为48.28%（14/29），非阳性表达患者的化疗有效率为40.63%（13/32），差异无统计学意义（P= 0.611）；TOPOⅡ阳性表达患者的化疗有效率为63.64% （14/22），非阳性表达患者的化疗有效率为33.33% （13/39），差异有统计学意义（P=0.032）（表2）。

表2 ERCC1、β-tubulin3及TOPOⅡ的表达与铂类化疗疗效的关系（n）

 

“*”表示中阳性表达（++～+++）；“**”表示阴性及无表达（-～+）

随着全球经济的高速发展以及环境污染的日益加剧，再加上吸烟人群的不断增多，使得肺癌高居全球新增癌症之首，年死亡人数达100多万，且每年的增长率＞25%。但目前肺癌的治疗和预后仍不能令人满意，这与其易发生、复发、转移以及化疗药物耐药有很大关系。随着对功能性基因组研究的深入，合理的个体化治疗成为一种新的趋势，2009年美国临床肿瘤学会年会中提出NSCLC治疗更应强调这一原则。铂类通过与肿瘤细胞形成铂-DNA聚合物，导致DNA复制障碍，从而抑制肿瘤细胞的分裂增殖，造成杀伤。铂类耐药的重要机制为核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）能力增强，通过NER清除铂-DNA聚合物，导致铂类失效。

ERCC1位于染色体19q13-2，全长15 kb，含10个外显子，编码含297个氨基酸的蛋白质。ERCC1与DNA修复酶缺乏互补基因，形成异源二聚体，具有5′端DNA核酸内切酶活性，可识别并切除受损DNA5′端，使铂类损伤的DNA得到迅速修复，从而导致耐药的发生。ERCC1活性的高低可反映整个NER修复活性的水平[5]，低表达会促使肺癌的发生和复发，但对铂类药物敏感；阳性表达可减少肿瘤的复发，但易引起耐药的发生[6]。近年来ERCC1表达与铂类耐药之间的关系得到广泛验证，Reynolds等[7]对晚期NSCLC的三期实验进行回顾性研究，应用荧光定量免疫组化方法检测ERCC1蛋白的表达，发现其与铂类方案疗效呈负相关；Olaussen等[8]研究761例NSCLC患者ERCC1的表达水平，证实阴性表达患者的总生存期明显高于阳性表达患者，且前者应用含铂辅助化疗能够明显延长生存期。本研究结果显示，ERCC1表达阴性组的化疗效果明显高于表达阳性组，差异有统计学意义，与目前多数文献的研究结果一致。Rybárová等[9]对107例NSCLC中的ERCC1蛋白表达进行相关性分析，认为ERCC1在NSCLC不同组织学类型表达差异无显著性，与本研究结果一致，因此检测ERCC1的表达有助于预测患者的预后及对铂类药物的化疗敏感性，对指导晚期NSCLC的个体化治疗方案能够提供一定的依据。

TOPOⅡ是机体内必不可少的核酶，直接参与DNA的转录、翻译、复制及染色体分离等过程，主要存在于SG2/M期[10-11]。TOPOⅡ的表达主要有两种作用：①可体现肿瘤细胞的增殖指数；②可作为肿瘤化疗药物作用的靶点，化疗药物通过与TOPOⅡ结合而使DNA复制和转录异常，阻碍肿瘤细胞的增殖。NSCLC肿瘤组织的TOPOⅡ表达水平可直接影响化疗药物的活性，TOPOⅡ表达水平越高，对化疗药物的敏感性就越高；反之，则导致肿瘤细胞的耐药[12-14]。本研究结果显示，TOPOⅡ蛋白表达与铂类化疗效果呈显著相关，且其表达程度与铂类化疗药物的疗效呈正相关，即阳性表达患者铂类化疗疗效好，阴性表达患者对铂类更易发生耐药，这与上述研究结果相吻合。

β-tubulin是微管结构的主要组成部分，而微管蛋白是细胞骨架的重要组成部分，在细胞有丝分裂中起重要作用，是紫杉醇类药物作用的靶点。其可分为7种亚型，其中β-tubulin 3的作用最为重要。文献报道，β-tubulin 3表达与紫杉醇类的化疗疗效具有相关性，而与铂类药物的耐药性是否相关尚不明确[15-19]。Huang等[20]的研究结果显示，NSCLC鳞癌患者的βtubulin 3阳性率与腺癌患者比较，差异无统计学意义。本研究结果显示，β-tubulin3的表达与铂类药物疗效无相关性。

综上所述，ERCCI及TOPOⅡ可作为预测NSCLC对铂类化疗药物疗效的生物学标志物，对临床用药及预后有一定的指导意义；但β-tubulin 3与铂类疗效无明确相关性，需继续扩大样本量以进行更深入的研究。

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Expression of ERCC1,β-tubulin 3 and TOPOⅡin advanced non-smallcell lung cancer and their relationship with clinical pathological features and efficacy of platinum based chemotherapy

ZHANG Chun-jie1JIANG Wei-mei2HAN Lei1SUN Yong-mei1▲
1.Department of Pathology,the Second People′s Hospital of Lianyungang City in Jiangsu Province,Lianyungang 222000, China;2.DepartmentofOncology,theSecondPeople′sHospitalofLianyungangCityinJiangsuProvince,Lianyungang 222000, China

[Abstract]ObjectiveTo explore the expressions of ERCC1,β-tubulin 3 and TOPOⅡin advanced non-small-cell lung cancer(NSCLC)and their correlations with clinical pathological features and efficacy of platinum based chemotherapy.Methods61 patients with NSCLC in our hospital from January 2012 to June 2013 were selected as the study subjects, mmunohistochemical method was used to detect the expression of tissue ERCC1 and β-tubulin 3 and TOPOⅡ,All the patientswere treated with Pemetrexed combined with Nedaplatin chemotherapy,and the efficacy was evaluated on a regular.ResultsThe express of ERCC1 and β-tubulin 3 was not related to the age,sex,clinical stage and histological type of the patient(P＞0.05).The expression of TOPOⅡwas not related to the age,sex,and clinical stage of the patients (P＞0.05).The positive expression of TOPOⅡin adenocarcinoma was 8 cases(22.86%),14 cases(53.85%)were positive in squamous cell carcinoma,and the positive expression of ERCC1,β-tubulin 3 and TOPOⅡ in squamous cell carcinoma was higher than that in adenocarcinoma,with significant difference(P=0.017).The positive expression of ERCC1, β-tubulin 3 and TOPOⅡwere 40.98%(25/61),47.54%(29/61)and 36.66%(22/61)respectively,the effective rate of positive expression of chemotherapy was 16.00%(4/25),48.28%(14/29)and 63.64%(14/22),the effective rate of negative expression of chemotherapy was 63.89%(23/36),40.63%(13/32)and 33.33%(13/39).ConclusionThe positive expression of ERCCI and TOPOⅡcan predict the efficacy of NSCLC in the treatment of platinum based chemotherapy drugs,and TOPOⅡhas important significance for the prognosis of advanced NSCLC with different histological types.

[Key words]Non-small-cell lung cancer;ERCC1;βtubulin 3;TOPOⅡ;Immunohistochemistry

[中图分类号]R734.2

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2016）12（b）-0007-04

（收稿日期：2016-11-09 本文编辑：祁海文）

[基金项目]江苏省连云港市卫生计生委科研项目（1319）

[作者简介]张春节（1985-），男，本科，主治医师，主要从事临床病理诊断工作

▲通讯作者：孙咏梅（1967-），女，本科，主任医师，主要从事临床病理诊断工作