余碧雅 林春燕 钟秀妹 余进胜

广东省惠州市惠东县人民医院妇产科，广东惠东516300

[摘要]目的探讨过氧化物还原酶Ⅰ（PrxⅠ）、Ⅱ在先兆早期流产患者子宫内膜中的表达及意义，从氧化应激方面探讨先兆早期流产的发病机制。方法选取2014年4月～2016年4月就诊于惠州市惠东县人民医院计划生育门诊的流产患者60例，其中符合早期自然流产患者30例（实验组），自愿人工流产终止妊娠者30例（对照组）。采集两组患者的流产蜕膜标本，采用免疫组化及免疫蛋白印记法检测组织中PrxⅠ、Ⅱ蛋白含量，比较两种蛋白在自然流产及正常早孕患者中的表达差异。结果实验组患者的蜕膜组织中PrxⅠ蛋白定性表达阳性率（40.0％）显著低于对照组（90.0％），其中实验组＋＋阳性率为6.7％、＋＋＋阳性率为3.3％，对照组＋＋阳性率为53.3％，＋＋＋阳性率为16.7％，差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组患者的蜕膜组织中PrxⅡ白定性表达阳性率（40.0％）显著低于对照组（93.3％），其中实验组＋＋阳性率为13.3％，＋＋＋阳性率为3.3％，对照组＋＋阳性率为56.7％，＋＋＋阳性率为20.0％，差异均有统计学意义（P＜0.05）。实验组患者的蜕膜组织中PrxⅠ及PrxⅡ蛋白表达量（0.217±0.018、0.224±0.021）均明显低于对照组（1.174±0.114、1.184±0.181），差异有统计学意义（t=31.942、29.481，均P＜0.05）。Pearson相关性分析结果显示，实验组滋养细胞中PrxⅠ和PrxⅡ在实验组蜕膜组织中的表达量呈正相关（r= 0.782，P＜0.05）。结论PrxⅠ和PrxⅡ两种蛋白表达具有相关性，均具有较强的抗氧化应激作用，该蛋白的大量丢失可能是自然先兆流产发生的主要机制之一。

[关键词]过氧化物还原酶Ⅰ；过氧化物还原酶Ⅱ；先兆流产；子宫内膜

自然流产是指自然状态（非人为目的造成）发生的流产，而早期流产则指发生在12周以前的流产，早期流产对女性人群的身体和心理均造成巨大的伤害，但其发病机制尚不完全清楚，自然流产诱因可能与胎儿染色体异常、母体因素、免疫功能异常、环境等多种因素相关[1]。目前，有关氧化应激与自然流产的关系备受关注，已有研究证实人类胚胎发育过程中，滋养细胞中产生大量氧化应激标志物，认为胎盘氧化应激可能是早期妊娠失败的原因之一[2]。过氧化物还原酶Ⅰ（PeroxiredoxinⅠ，PrxⅠ）和过氧化物还原酶Ⅱ（PeroxiredoxinⅡ，PrxⅡ）在多种组织细胞质中表达，尤其在氧化应激时产生增多[3]。因此，探讨PrxⅠ和PrxⅡ在先兆自然流产和正常妊娠患者子宫蜕膜中的表达，有助于了解氧化应激在自然流产中的作用机制。

1.1 一般资料

选取2014年4月～2016年4月就诊于广东省惠州市惠东县人民医院（以下简称“我院”）计划生育门诊的流产患者60例，其中符合早期自然流产者30例（实验组），自愿人工流产终止妊娠者30例（对照组），自然流产诊断符合《妇产科学》第9版标准，结合妊娠周期、临床表现及辅助检查资料确诊。年龄24～41岁，平均（28.5±9.4）岁，孕龄5～12周，平均（9.5± 2.8）周。所有患者均无不良孕产史、生殖系统疾病，自愿参与研究并签署知情同意书。两组患者年龄、孕龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 试验方法

1.2.1 主要试剂和仪器本次研究所使用的主要试剂有免疫组织化学SP法试剂盒、PrxⅠ多克隆抗体、PrxⅡ多克隆抗体、山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体及Bouin液，所有试剂均来源于北京中山生物技术有限公司；主要仪器有Leica CM1900冰冻切片机（Leica）、DML2000杂交捕获系统（美国Digene公司）、LightCycler480扩增仪（德国Roche公司）；其中生理盐水、10％甲醛水溶液、3％H2O2-甲醇、石蜡、磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2～7.6）、蒸馏水、中性树胶等均由我院实验室提供。

1.2.2 采集标本采集两组患者的流产蜕膜标本，采用生理盐水冲洗标本，分装于冻存管（EP管）中，在EP管上做好试验标记，并立即置于-80℃冰箱中保持备用，以上操作时间不超过5 min，此份样品用于Western blot检测，剩余部分蜕膜组织采用生理盐水冲洗，去除血液和黏液，置于10％甲醛水溶液中，存放于-4℃冰箱中待用，此份样品用于免疫组织化学分析。

1.2.3 Pr xⅠ和Pr xⅡ蛋白表达水平的检测应用免疫组织SP法检测两组蜕膜组织中PrxⅠ和PrxⅡ蛋白定性表达情况，两组患者蜕膜组织均置于Bouin液中固定过夜，常规脱水、石蜡包埋，制成5μm厚切片，切片常规脱蜡入水，3％H2O2-甲醇溶液中15min，以消除内源性过氧化酶。实验组：正常山羊血清室温孵育30 min，PrxⅠ多克隆抗体1∶1500、PrxⅡ多克隆抗体1∶1000稀释，37℃孵育2 h。山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育45 min，DAB显色，脱水封片观察。对照组：采用PBS取代一抗，其余步骤同上。采过Western blot法检测两组蜕膜组织中PrxⅠ和PrxⅡ蛋白定量表达情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；等级资料两组间的比较采用非参数秩和检验；采用Pearson相关分析PrxⅠ和PrxⅡ表达的相关性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 两组蜕膜组织中PrxⅠ蛋白定性表达情况

实验组患者的蜕膜组织中PrxⅠ蛋白定性表达阳性率[40.0％（12/30）]显著低于对照组[90.0％（27/ 30）]，其中实验组＋＋、＋＋＋阳性率均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 两组蜕膜组织中PrxⅠ蛋白定性表达情况[n（％）]

 

两组比较，H=27.192，P＜0.05

2.2 两组蜕膜组织中PrxⅡ蛋白定性表达情况

实验组患者的蜕膜组织中PrxⅡ蛋白定性表达阳性为40.0％（12/30），显著低于对照组的93.3％（28/ 30），其中实验组＋＋、＋＋＋阳性率明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 两组蜕膜组织中PrxⅡ蛋白定性表达情况[n（％）]

 

两组比较，H=26.281，P＜0.05

2.3 两组蜕膜组织中PrxⅠ和PrxⅡ蛋白定量表达情况

实验组患者的蜕膜组织中PrxⅠ蛋白定量和PrxⅡ蛋白定量显著低于对照组，差异均有统计学意义（t=31.942，P＜0.05；t=29.481，P＜0.05）（表1）。

表3 两组蜕膜组织中PrxⅠ和PrxⅡ蛋白定量表达情况（±s）

2.4 滋养细胞中PrxⅠ和PrxⅡ表达的相关性分析

Pearson相关性分析结果显示，实验组滋养细胞中PrxⅠ与PrxⅡ的表达呈正相关（r=0.782，P＜0.05）。

近年来，自然流产与氧化应激的作用关系是目前的研究热点。研究认为[4]，超声检测绒毛血流信号较低，这可能与子宫螺旋动脉官腔被绒毛滋养细胞堵塞有关，导致妊娠早期胚胎发育处于低氧环境[5-7]。正是这种低氧分压、低血流灌注的发育缓解，有利于避免分化细胞收到大量活性氧自由基的损伤[8]。但是，当母体血流逐渐进入胎盘组织后，细胞之前的缺氧环境逐渐被新的血液循环替代，在这两种血液循环环境转换的过程中，容易产生大量活性氧自由基，机体为减少再损伤，需要产生大量抗氧化物质，从而清除大量活性氧，已达到氧化与抗氧化的平衡状态，保证妊娠环境的良好维持[9-11]。但是当机体抗氧化能力不足，大量活性氧蓄积，容易导致蛋白质及脂质氧化损伤，染色体缺乏稳定性，诱发细胞凋亡，最终导致妊娠失败[12]。

人体的抗氧化体系包括氧化剂和抗氧化酶，其含量减低提示机体的抗氧化能力降低，较易受到氧化应激的损伤[13-14]。研究发现[15]，先兆自然流产患者体内发生显著的氧化损伤，较正常妊娠患者的抗氧化能力显著降低，这种氧化与抗氧化水平的失衡，容易导致机体产生大量氧自由基，产生一系列氧化应激反应[16-18]。妊娠早期，绒毛滋养细胞中存在大量抗氧化物酶，其与胚胎的着床、发育、细胞分裂密切相关[19-20]。PrxⅠ和PrxⅡ是抗氧化蛋白超家族成员之一，具有抗氧化及清除氧自由基作用，参与多种组织细胞的增殖，是细胞信号传导中的重要信使，参与了细胞的分化与凋亡[20]。

本研究发现，早期先兆流产患者的蜕膜组织中PrxⅠ、PrxⅡ蛋白定性表达阳性率均显著低于正常妊娠患者，其中实验组++、+++阳性率均低于对照组，进一步证实早期先兆流产患者的抗氧化应激作用较弱。Western blot法分析发现，实验组患者的蜕膜组织中PrxⅠ、PrxⅡ蛋白定量低于对照组，两组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。Pearson相关性分析，实验组滋养细胞中PrxⅠ和PrxⅡ表达具有相关性（r=0.782，P＜0.05），两者在自然流产蜕膜组织中的表达量呈正相关，以上结果显示，两种蛋白均参与了妊娠期间蜕膜组织张的抗氧化应激作用。

综上所述，PrxⅠ和PrxⅡ两种蛋白表达具有正相关性，提示PrxⅠ可能与PrxⅡ具有协同调控的作用机制，两者均具有较强的抗氧化应激作用，此种蛋白的大量丢失，容易造成胎盘DNA的氧化损伤和染色体裂解，是导致自然先兆流产发生的主要作用机制之一。

[1]李萍.MMP-9和TIMP-3在早孕先兆流产绒毛及蜕膜中的表达[J].泰山医学院学报，2007，28（2）：113-115.

[2]黑国真，董素芹，刘慧泽.SOD、脂质过氧化物、CP与自然流产的相关性[J].潍坊医学院学报，2009，31（6）：448-449.

[3]段婷，姚兵.过氧化物还原酶蛋白家族与疾病[J].医学研究生学报，2015，28（1）：98-101.

[4]Nigro G，Mazzocco M，Mattia E，et al.Role of the infections in recurrent spontaneous abortion[J].JMatern Fetal Neonatal Med，2011，24（8）：983-989.

[5]曾琼芳，段金良，蒋元华，等.IVF/ICSI妊娠后早期流产相关因素分析[J].中国性科学，2013，22（2）：37-39.

[6]Pak JH，Choi WH，Lee HM，et al.Peroxiredoxin 6 overexpression attenuates cisplatin-induced apoptosis in human ovarian cancer cells[J].Cancer Investig，2011，29（1）：21-28.

[7]Wu B，Yu H，Wang Y，et al.Peroxiredoxin-2 nitrosylation facilitates cardiomyogenesis ofmouse embryonic stem cells via XBP-1s/PI3K pathway[J].Free Radic Biol Med，2016，97：179-191.

[8]张华.人绒毛膜促性腺激素联合血清孕酮检测用于预测早期流产的可行性分析[J].中国医疗前沿，2013，8（12）：90-90.

[9]刘玉昆，陈欣，刘颖琳，等.高龄早期复发性流产患者流产原因分析[J].中山大学学报（医学科学版），2013，34（4）：646-650，封3.

[10]Tahmasbpour ME，Ghanei M，Panahi Y.Oxidative stress and altered expression o f peroxiredoxin genes family（PRDXS）and sulfiredoxin-1（SRXN1）in human lung

tissue following exposure to sulfur mustard[J].Exp Lung Res，2016，42（4）：217-226.

[11]Duan T，Fan K，Chen S，et al.Role of peroxiredoxin 2 in H2O2 induced oxidative stress of primary Leydig cells[J]. Mol Med Rep，2016，13（6）：4807-4013.

[12]Sharapov MG，Novoselov VI，Ravin VK.Xenopus laevis peroxiredoxins：gene expression during development and characterization of the enzymes[J].Mol Biol（Mosk），2016，50（2）：336-346.

[13]Alimohamadi S，Javadian P，Gharedaghi MH，et al.Progesterone and threatened abortion：a randomized clinical trial on endocervical cytokine concentrations[J].JReprod Immunol，2013，98（1/2）：52-60.

[14]Xie YJ，Chen M，Chen SJ，et al.Prediction of pregnancy outcomes with combined ultrasound scanning of yolk sacs and serum CA 125 determinations in early threatened abortion[J].Clin Exp Obstet Gynecol，2014，41（2）：186-189.

[15]Menzhinskaya IV，Van'ko LV，Kiryushchenkov PA，et al. Spectrum of antibodies to reproductive hormones in threatened abortion[J].Bull Expe Biol Med，2014，157（6）：747-750.

[16]Keskin U，Ulubay M，Dede M，et al.The relationship between the VEGF/sVEGFR-1 ratioand threatened abortion[J]. Arch Gyneco Obstet，2015，291（3）：557-561.

[17]Murtaza UI，Ortmann MJ，Mandovandrick J，et al.Management of first-trimester complications in the emergency department[J].Am JHealth Syst Pharm，2013，70（2）：99-111.

[18]罗桂英，王蒙蒙，王春艳，等.179例试管婴儿孕妇发生先兆流产的病例对照研究[J].安徽医科大学学报，2015，50（11）：1634-1638.

[19]蔺雪晴，蒋宏.两种血清联合预测早期妊娠先兆流产预后的价值[J].检验医学与临床，2013，10（17）：2222-2223.

[20]Lane BF，Wong-You-Cheong JJ，Javitt MC，et al.ACR appropriateness criteria?first trimester bleeding[J].Ultrasound Q，2013，29（2）：91-96.

Clinical expression and significance of PrxⅠand PrxⅡfor patients w ith threatened abortion

YU Bi-ya LIN Chun-yan ZHONG Xiu-mei YU Jin-sheng
Department of Obstetrics and Gynecology,Huidong County People′s Hospital of Huizhou City,Guangdong Province, Huidong 516300,China

[Abstract]Objective To study the clinical expression of PeroxiredoxinⅠ(PrxⅠ)and PeroxiredoxinⅡ(PrxⅡ)for patients with threatened abortion and explore the pathogenesis of threatened abortion from the aspects of oxidative stresss.M ethods Sixty patients with threatened abortion treated from April 2014 to April 2016 in the Huidong County People′s Hospital of Huizhou City were selected.30 cases of patients adopting the spontaneous abortion were selected as experimental group；30 cases of adopting the induced abortion were selected as control group.The specimen of decidua was collected.Through the immunohistochemicalmethod and western blot,the content of PrxⅠand PrxⅡfor spontaneous abortion and early pregnancy group was detected and compared.Results The positive rate of PrxⅠin the decidual tissues of the experimental group(40.0％)was lower than that of the control group(90.0％)；the positive rate of (＋＋)and(＋＋＋)in experimental group(6.7％,3.3％)was lower than those of the control group(53.3％,16.7％),the difference was statistically significant(P＜0.05).The positive rate of PrxⅡin the decidual tissues of the experimental group(40.0％)was lower than that of the control group(93.3％)；the positive rate of PrxⅡin the decidual tissues of the experimental group(40.0％)was lower than that of the control group(90.0％)；the positive rate of(＋＋)and(＋＋＋)in the experimental group(13.3％,3.3％)was lower than those of the control group(56.7％,20.0％),the difference was statistically significant(P＜0.05)；the expression of PrxⅠand PrxⅡprotein in the decidual tissues of the experimental group(0.217±0.018,0.224±0.021)was lower than that of the control group(1.174±0.114,1.184±0.181),the differences were statistically significant(t=31.942,29.481,all P＜0.05).Pearson correlation analysis showed that,the expression of PrxⅠprotein was positively correlated with PrxⅡprotein in the decidual tissues of the experimental group(r=0.782,P＜0.05).Conclusion The expression of PrxⅠand PrxⅡis positively correlated with each other and has the stronger oxidative stress.The loss of the proteinmay be themajormechanism of threatened abortion.

[Key words]PrxⅠ；PrxⅡ；Threatened abortion；Endometrium

[中图分类号]R715.2

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2016）11（b）-0083-04

（收稿日期：2016-09-10本文编辑：任念）

[基金项目]广东省惠州市科技项目（2014Y242）