卢俊1琚幼婷2胡衍辉1陈受琳1蔡俊赢1李昌1

1.南昌大学第二附属医院麻醉科，江西南昌330006；2.南昌大学附属口腔医院麻醉科，江西南昌330006

[摘要]目的研究Compound C对布比卡因神经毒性损伤的影响及作用机制。方法健康雄性SD大鼠18只，随机分为3组，每组6只。对照组（N组）：鞘内注射生理盐水30μl，腹腔注入生理盐水；2％布比卡因组（B组）：鞘内注射2％布比卡因30μl，腹腔注入生理盐水；2％布比卡因＋Compound C组（B＋C组）：鞘内注射2％布比卡因30μl，腹腔注入Compound C 20mg/kg。各组大鼠处理后2 h、3 h、4 h、1 d和2 d利用弗莱毛测痛法测量机械痛阈，并进行下肢运动功能（MF）评分。处理3 d处死各组大鼠，采用荧光定量PCR检测各组大鼠背根神经节中单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）的表达。结果鞘内注射布比卡因30min后，B组和B＋C组的MF评分较N组明显增高（P＜0.05），4 h后B组和B＋C组运动功能恢复正常。在鞘内注射布比卡因1 d后，B组的机械痛阈低于B＋C组和N组（P＜0.05）。荧光定量PCR结果显示，B＋C组AMPK表达低于B组及N组（P＜0.05）。结论Compound C可减轻布比卡因神经毒性损伤作用，其机制可能是通过抑制AMPK的表达从而保护神经组织细胞。

[关键词]神经毒性；布比卡因；单磷酸腺苷激活的蛋白酶

随着局部麻醉药在临床广泛的使用，其周围神经毒性逐渐引起重视。在临床上以短暂神经综合征最常见，表现为下肢疼痛、感觉异常，可伴有尿潴留等症状。局部麻醉药周围神经毒性机制涉及细胞能量代谢、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein

kinase，MAPK）信号转导途径、兴奋性氨基酸释放和细胞内Ca2＋含量变化等多个因素。研究发现，布比卡因可抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ并干扰氧化磷酸化，导致ATP生成减少、细胞内活性氧族（ROS）产生增多和线粒体膜电位降低[1-3]。单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，普遍存在于真核细胞中，并且是高度保守的蛋白激酶，它主要对能量代谢进行调控以协调细胞的代谢状态和能量需要。当细胞内ATP减少、AMP/ ATP比例增高时，AMPK激酶被激活，抑制合成代谢途径，以减少ATP的消耗，并同时促进分解代谢途径，增加细胞内ATP的产生。因此，AMPK被称为“细胞能量调节器”。有研究证实，AMPK的持续激活可引起细胞内ROS产生增多并导致细胞凋亡[4-5]。研究表明，布比卡因可通过AMPK途径导致细胞的ROS水平增高和细胞凋亡[6]。

Compound C是一种AMPK抑制剂，可抑制AMPK磷酸化，阻断AMPK依赖性细胞凋亡[7-8]。目前研究发现，Compound C可以减轻内毒素血症模型小鼠肝脏组织损伤，抑制肝细胞凋亡。Compound C是否可以抑制布比卡因神经毒性损伤作用还未见报道。本研究通过建立布比卡因神经毒性损伤模型，观测机械痛阈变化和AMPK的表达，探讨Compound C对布比卡因神经毒性损伤作用的影响及其机制。

1.1 实验动物

雄性SD大鼠，体重180～200 g，购自南昌大学医学院动物科学部。在恒温22℃，相对温度40％～70％的环境内饲养，正常饮食饮水。

1.2 试剂与仪器

AMPK引物购自上海英骏生物技术有限公司；盐酸布比卡因分析品购自美国Sigma公司（批号：014252803）；PCR仪（型号：7900HTFAST，ABI公司，美国）；Compound C干粉购自美国Sigma公司；弗莱毛测痛针（Stoelting公司，美国）。

1.3 方法

1.3.1 实验分组与处理健康雄性SD大鼠18只，采用10％水合氯醛腹腔内注射麻醉，于L5～L6椎间隙向头侧入PE导管2 cm，见清亮脑脊液从导管中流出后固定导管，埋于皮下。将鞘内置管大鼠随机分为3组（n=6）。对照组（N组）：鞘内注射生理盐水30μl，腹腔注入生理盐水；2％布比卡因组（B组）：鞘内注射2％布比卡因30μl，腹腔注入生理盐水；2％布比卡因＋Compound C组（B＋C组）：鞘内注射2％布比卡因30μl，腹腔注入Compound C 20mg/kg。

1.3.2 弗莱毛测痛阈各组SD大鼠处理后2 h、3 h、4 h、1 d和2 d后利用弗莱毛测痛法测量机械痛阈。将大鼠置于笼中，熟悉环境后，用弗莱毛刺激大鼠后足部，以大鼠抬起后肢为反应阳性。弗莱毛的强度分别为0.09、0.18、0.27、0.51、1.08、3.85、5.50、7.05 g。每一强度的弗莱毛刺激10次，记录反应率，并且计算反应率为50％时弗莱毛的强度为50％机械缩足阈值。

1.3.3 下肢运动功能评分下肢运动功能评分标准：无阻滞为0分，部分阻滞为1分，完全阻滞为2分。双下肢的评分相加为测定值。鞘内注射后30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、1 d和2 d测定下肢运动功能。下肢运动功能评分由2名实验员共同观测评价后确定评分。

1.3.4 荧光定量PCR检测3 d后各组大鼠行断颈处死。取后背部正中切口，分离肌肉，去除棘突和部分椎板，剪取背根神经节。组织细胞匀浆后提取总RNA后进行逆转录反应，并将产物进行荧光定量PCR扩增和检测。AMPK序列：正义链：5′-CAGGCACATGGTTGTCCACAG-3′；反义链：5′-AATTTGGCGATCCACAGCTAGTTC-3′。反应体系为50μl，其中2×Mix SYBRGreenⅠ荧光反应液10μl，上下游引物各1μl，样品模板5μl，dNTP 1μl，Tag聚合酶2μl，灭菌水补足30μl体系。反应条件93℃2 min预变性，循环内93℃1min，55℃1min，72℃1min，共40个循环，最后72℃7min，并在每个循环延伸末端点收集荧光信号，绘制扩增曲线。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布计量资料的均数用均数±标准差表示，不同时间按点比较采用重复测量设计的方差分析；AMPK表达量改用中位数和第10、90位点百分位数表示[M（P10，P90）]，两组间比较采用Kruskal-Wallis H，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 各组大鼠机械性痛阈的变化

弗莱毛法测机械痛阈结果显示，在鞘内注射布比卡因2、3、4 h后，B组和B＋C组的机械痛阈值比较，差异无统计学意义（F=2.71，P＞0.05）；在鞘内注射布比卡因1 d后，B组的机械痛阈值为（2.51±1.07）g，而B＋C组和N组分别为（4.73±1.66）g和（4.58±1.82）g，B组低于B＋C组和N组，差异有统计学意义（F= 4.26，P＜0.05），B＋C组与N组比较差异无统计学意义（t=1.13，P＞0.05）；在鞘内注射布比卡因2 d后B组的机械痛阈值仍低于B＋C组和N组（F=4.83，P＜0.05），而B＋C组与N组比较差异无统计学意义（t=1.27，P＞0.05）（表1）。

表1 各组机械性痛阈的变化（g，n=6）

 

与B组同期比较，*P＜0.05

2.2 各组大鼠运动功能的变化

各观察时间点，注药前各组大鼠运动功能正常，下肢运动功能评分均为0分。鞘内注射布比卡因30min后，B组和B＋C组大鼠下肢运动功能评分均较N组显著增高（H=8.86，P＜0.05），B组与B＋C组比较差异无统计学意义（H=3.56，P＞0.05）；1、2 h后，B组和B＋C组大鼠下肢运动功能评分均较N组显著增高（H= 7.97、9.24，均P＜0.05），B组和B＋C组比较差异无统计学意义（H=3.23、4.01，P＞0.05）；B组和B＋C组大鼠运动功能于注药4 h后均恢复正常，B组与B＋C组及N组比较，差异均无统计学意义（H=2.75、2.75，均P＞0.05），B＋C组与N组比较差异无统计学意义（H= 3.19，P＞0.05）；在6 h、1 d、和2 d观测下肢运动功能得到的评分均为0分（表2）。

表2 各组大鼠下肢运动功能的变化[分，M（P10，P90），n=6]

 

与N组同期比较，*P＜0.05；“-”表示无数据

2.3 AMPK表达的变化

荧光定量PCR结果显示，N组AMPK表达量为1.00±0.03，B组为1.55±0.03，B＋C组为0.65±0.02。与N组比较，B组AMPK表达明显增高（H=5.92，P＜0.05），B＋C组的AMPK表达低于B组及N组（H= 6.76、7.32，均P＜0.05）。

研究报道，布比卡因可抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ，使线粒体氧化磷酸化解耦联，导致ATP生成减少，增加线粒体的通透性和降低线粒体膜电位。Cai等[9]研究发现，当AMP增多而ATP减少时可激活AMPK。在β细胞中AMPK的持续激活可引起ROS的产生增加。Park等[10]发现布比卡因可诱导Schwann细胞内的ROS增多，并激活caspase-3（细胞内与凋亡有关的蛋白酶），触发细胞凋亡。研究表明[11-12]，某些触发因素使部分线粒体产生、释放ROS，通过ROS诱导ROS释放（ROS-induced ROS-release，RIRR）机制，正反馈性诱发周边正常线粒体产生、释放大量的ROS，即导致ROS爆发；后者引起线粒体膜电位降低，诱发线粒体释放凋亡因子以及造成神经细胞的其他损伤。Lu等[6]研究发现，通过AMPK-shRNA下调AMPK的表达可抑制布比卡因导致的神经细胞ROS爆发，并减少细胞凋亡。因此，布比卡因的神经细胞毒性作用与AMPK的持续激活密切相关。

Compound C是一种有效的、可逆的、选择性的AMPK抑制剂，对PKA、PKC和JAK等结构相关的激酶没有显著的抑制作用，它可通过多种机制对细胞产生保护效应[1,13]。有研究表明，Compound C通过抑制AMPK的激活，改善受到缺氧处理的PC12细胞的活力[4]。有实验研究发现，腹腔内注射20 mg/kg的Compound C可有效降低缺血诱发的动物脑损伤[15]。因此，本研究在布比卡因神经毒性损伤动物模型中经腹腔注射Compound C采用的剂量为20mg/kg。

本研究弗莱毛法测机械痛阈结果显示，在鞘内注射布比卡因2、3、4 h后，B组和B＋C组机械痛阈值无明显差异，但在1 d后B组的机械痛阈值低于B＋C组和N组，在用药2 d后B组的机械痛阈值仍低于B＋C组和N组。这提示Compound C可以改善布比卡因造成的感觉功能异常。在鞘内注射布比卡因30 min至2 h后，B组和B＋C组与N组比较，下肢运动功能评分明显增高，4 h后B组和B＋C组运动功能恢复正常。荧光定量PCR结果显示，B＋C组AMPK表达低于B组。这说明Compound C抑制AMPK的激活后减少了布比卡因对细胞的损伤，从而也避免了AMPK的持续表达。

综上所述，本研究提示布比卡因通过AMPK途径造成神经组织细胞损伤，Compound C可抑制AMPK的激活，减少了布比卡因对神经细胞的损伤作用。局部麻醉药的神经毒性作用机制错综复杂，本研究在AMPK介导布比卡因神经毒性机制中的探讨为防治局部麻醉药神经毒性提供了新的思路。

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Effect and mechanism of Com pound C on the neurotoxic injury of Bupivacaine

LU Jun1JU You-ting2HU Yan-hui1CHEN Shou-lin1CAIJun-ying1LIChang1
1.Department of Anesthesiology,the Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Jiangxi Province,Nanchang 330006,China;2.Department of Anesthesiology,Affiliated Stomatological Hospital of Nanchang University,Jiangxi Province,Nanchang 330006,China

[Abstract]Objective To investigate the effect of Compound C on neurotoxicity injury of Bupivacaine and mechanism. M ethods Eighteen normalmale SD ratswere divided into 3 groups randomly,6 rats in each group.Normal group(group N):the rats were received intrathecal injection with normal 30μl and intraperitoneal injection with normal saline;2％ Bupivacaine group(group B):the ratswere received intrathecal injection with 2％Bupivacaine 30μl and intraperitoneal injection with normal saline.2％Bupivacaine combined with Compound C group(group B＋C):the ratswere received intrathecal injection with 2％Bupivacaine 30μl combined with intraperitoneal injection with 20 mg/kg Compound C.The thresholds ofmechanical pain were measured by using Von-Frey hair at 2 h,3 h,4 h,1 d,and 2 d after treatment,and motor function(MF)score was performed.The ratswere sacrificed 3 d after treatment and the expression of AMPK in the dorsal root ganglia of rats was examined by fluorescent quantitation PCR.Results 30 min after intrathecal injection with Bupivacaine,compared with the group N,the MF scores of the group B and group B＋C were increased obviously (P＜0.05),and the MF scores of the group B and group B＋C were recovered 4 h after treatment.1 d After intrathecal in jection with Bupivacaine,the thresholds ofmechanical pain decreased in group B,compared with those of group B＋C and group N(P＜0.05).The fluorescent quantitation PCR results indicated that,the expressions of AMPK in group B＋C was lower than that of the group B and group N(P＜0.05).Conclusion Compound C can attenuate the neurotoxicity injury of Bupivacaine,and themechanism may be that it inhibited the expression of AMPK and protected the neural cells.

[Key words]Neurotoxicity;Bupivacaine;AMPK

[中图分类号]R614.1

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2016）11（b）-0007-04

（收稿日期：2016-08-10本文编辑：任念）

[基金项目]江西省卫生计生委科技计划项目（20161075）

[作者简介]卢俊（1978-），男，博士，主治医师，研究方向：麻醉学