王　梅1　胡晓彤2　戚大石1　王　蕾2　张　芳2▲

1.徐州医科大学形态学实验教学中心江苏省脑病重点实验室，江苏徐州　221004；2.徐州医科大学形态学实验教学中心，江苏徐州　221004

［摘要］目的探讨脑缺血/再灌注是否通过神经性一氧化氮合酶（nNOS）诱导KA受体亚基GluR6巯基亚硝基化。方法将28只SD大鼠随机分成4组，每组7只：假手术组、脑缺血/再灌注6 h组、脑缺血/再灌注6 h合并给药组、脑缺血/再灌注6 h溶剂对照组。采用四动脉结扎法构建大鼠全脑缺血模型，给予SD大鼠腹腔注射nNOS的抑制剂7-硝基吲唑。主要应用“生物素转化法”、SDS-PAGE、免疫印迹等方法对GluR6的蛋白表达及其巯基亚硝基化水平进行研究。结果脑缺血/再灌注组与假手术组相比GluR6的巯基亚硝基化水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；脑缺血/再灌注联合nNOS的抑制剂7-NI组与脑缺血/再灌注组相比，GluR6的巯基亚硝基化水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；各组GluR6的蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论在脑缺血/再灌注早期nNOS诱导GluR6的巯基亚硝基化，为缺血性脑损伤疾病的治疗提供了新的理论依据。

［关键词］谷氨酸受体6；脑缺血再灌注；巯基亚硝基化；神经性一氧化氮合酶

脑缺血/再灌注导致严重的脑损伤［1］，研究脑缺血/再灌注导致损伤的内在机制已被广泛关注，但其具体的作用机制尚未研究明确。谷氨酸等兴奋性氨基酸的毒性作用在脑缺血/再灌注引起的迟发性神经元死亡中发挥重要作用［2-3］，且主要是通过凋亡机制实现的。兴奋性氨基酸受体如海人藻酸（kainic acid，KA），AMPA和N-甲基天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）等的过度激活均与诱导细胞凋亡有关［4］。相关研究表明，全脑缺血/复灌能够促进KA受体亚基谷氨酸受体6（Glutamate receptor 6，GluR6）介导的GluR6、MLK3和PSD95三种蛋白的募集，且在复灌6 h时三者结合达到最高点，三者的结合进一步促进c-Jun N-末端激酶（JNK）信号通路的激活，从而介导了海马CA1区神经元的凋亡［5-6］。所以，对于GluR6的调控是非常关键的。

蛋白质巯基亚硝基化（S-nitrosylatiom；S-亚硝基化），可以通过共价修饰蛋白质的半胱氨酸残基来调节蛋白质的功能，是转录后蛋白质修饰方式中的一种。蛋白质的S-亚硝基化通过一氧化氮（nitric oxide，NO）共价结合到蛋白质半胱氨酸侧链上，且不需要酶的参与［7-8］。蛋白质发生S-亚硝基化后其活性受到调控，导致特异性的生理或病理活动，是调控蛋白质转录后功能的重要机制［9-11］。

在脑缺血/复灌早期的神经元中，已经证明了NO主要来源于神经性一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）［12-13］。nNOS、内皮性细胞一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和诱导性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）是被鉴别出的三种已知能产生内源性NO的酶。存在于脑中的主要是nNOS和iNOS，其中nNOS主要表达于脑神经元，且与神经元早期损伤有关；而iNOS主要在巨噬细胞、小胶质细胞、神经细胞和星形胶质细胞中表达，且主要在病理条件下由炎症介质诱导表达，与神经元后期的损伤有关［14］。基于以上的研究，本实验主要探讨在脑缺血/复灌早期，nNOS来源的NO是否介导了KA受体亚基GluR6的巯基发生S-亚硝基化。

1.1　材料

清洁级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，250～300 g，共28只，由本校实验动物中心和中科院上海实验动物中心提供，羊多克隆抗GluR6（sc-7618）购于Santa Cruz Biotechnology公司，兔多克隆抗SNO-Cys（N 5411）购于Sigma-Aldrich公司，NC膜购于Amersham公司，NBT/BCIP购于Promega公司，牛血清白蛋白 （组分V）购于Amresco公司，常用试剂均为国产分析纯，工具药（7-NI）和部分化学试剂从Sigma-Aldrich公司购得。

1.2　方法

1.2.1　脑缺血/再灌注模型的建立 将SD大鼠随机分成4组，每组7只：假手术组（Sham组）、脑缺血/再灌注6 h组（I/R 6 h组）、脑缺血/再灌注给药组（I/R 6 h+ 7NI组）、脑缺血/再灌注6 h溶剂对照组 （I/R 6 h+ DMSO组）。I/R 6 h组采用大鼠四动脉结扎（4-VO）模型［15］，腹腔注射20%水合氯醛（300～350 mg/kg）麻醉后，分离出双侧颈总动脉，颈总动脉上留细线，并电凝椎动脉。恢复过夜，第2天，于清醒状态下提起颈总动脉上细线分别以动脉夹夹闭双侧颈总动脉15min后取下动脉夹，再灌注6 h后断头取脑。在整个缺血过程中大鼠直肠温度保持36.5～37.5℃，以缺血动物体征表现判断缺血模型的可靠性。Sham组处理同I/R 6 h组，但不以动脉夹夹闭双侧颈总动脉；脑缺血/再灌注给药组建模同I/R 6 h组，在缺血前20 min腹腔注射给予溶于1%DMSO的7-NI 25mg/kg；脑缺血/再灌注6 h溶剂对照组建模同脑缺血/再灌注给药组，在缺血前20min给予相同体积的1%DMSO作为对照。

1.2.2　蛋白样品的制备　再灌注6 h后，快速断头取脑，分离双侧海马CA1区，放液氮中冻存。蛋白的提取需在冰水浴中进行：取液氮中冻存的CA1区组织，加入匀浆缓冲液，以Glas-col匀浆器（10 s×6次）高速匀浆，4℃1000×g离心15min，小心移取上清液，即为胞浆蛋白组分。

1.2.3　蛋白含量的测定 从1.2.2中提取的胞浆蛋白组分，以牛血清白蛋白为标准蛋白，按照改良Lowry法［16］，测定蛋白含量。

1.2.4　蛋白S-亚硝基化的测定 采用生物素转化法（Biotin-Switchmethod）［17］，整个实验过程中避光并使用毛面试管。实验方法如下：液氮中取出CA1组织后，以含250mmol/L HEPES-NaOH，pH=7.7，1mmol/L EDTA，0.1 mmol/L neocuproine的 HEN液匀浆，4℃1000×g离心10min，留取上清；上清组分测蛋白浓度，统一调整蛋白浓度至0.4 g/L，按0.4 mg蛋白分装，以HEN液补充总体积到1m l；分装的蛋白中加入10% CHAPS调整终浓度为0.4%，加入4倍体积blocking buffer，置于50℃水浴20 min，并不断摇匀；取出后加入2倍体积冰丙酮并放入-20℃冰箱20～30 min，取出后4℃2000×g离心10 min，留沉淀；沉淀中加HENS 液0.1 L/g重悬，转入EP管中，加1/3重悬液体积的4 mmol/L Biotin-HPTP，再加重悬液体积1/5的Ascorbate solution，25℃水浴1 h；取出后加入2倍体积的冰丙酮并放入-20℃冰箱，20 min，取出后4℃2000×g离心10min，弃去上清；沉淀中加入0.1mg/ml HENS液重悬，加2倍体积含20 mmol/L HEPES-NaOH，pH=7.7，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.5%Tri tonX-100的中和液，再加入15μl/mg Steptavidin-Agarose，于冷库中旋转混匀1 h；取出后每管中加入含600 mmol/L NaCl的中和液0.5～0.6 ml，洗5次，4℃10 000转，离心1 min；加入含20 mmol/L HEPES-NaOH，pH=7.7，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L ED-TA，和100 mmol/L 2-巯基乙醇的洗脱液，4×sample buffer，混匀煮沸5min，冷却待用。

1.2.5　蛋白免疫印迹（immunob l ot，IB）向分装好的样品中加入1/3样品体积的4×蛋白上样缓冲液，煮沸5 min。取100μg的变性蛋白质样品，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，半干转至NC膜上。将NC膜放入封闭液中3 h室温孵育后，取出放入一抗工作液，放4℃冰箱中过夜，取出以TBST洗膜（5min×3次）后，放入AP标记的二抗工作液中室温孵育2 h，取出以TBST洗膜（3 min×5次）后水洗。放入新鲜配制的AP显色液中显色，待显色完全后流水洗涤终止反应。扫描NC膜上显色条带，各组条带的OD值以同一张膜上同一条带Sham组的倍数表示，采用Quantity One分析软件分析统计。

1.3　统计学分析

采用Image J 1.37，Sigma STAT32，Sigma PLOT9分析软件，实验数据以均数±标准差（x依s）表示，组间比较采用one-way ANOVA，多个实验组与一个对照组比较采用LSD。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1　脑缺血/再灌注以及7NI对GluR 6 S-亚硝基化及其蛋白表达水平的IB检测

I/R 6 h组GluR6的S-亚硝基化水平高于Sham组；I/R 6 h+7NI组GluR6的S-亚硝基化低于I/R 6 h组；I/R 6 h+DMSO组GluR6的S-亚硝基化与I/R 6 h组相比无明显变化；各处理组GluR6的蛋白表达水平无明显变化（图1）。

 

图1　脑缺血/再灌注以及7NI对GluR6 S-亚硝基化及其蛋白表达水平的IB检测

2.2　脑缺血/再灌注通过 nNOS诱导了 KA受体GluR 6的S-亚硝基化

I/R 6 h组GluR6的S-亚硝基化水平与Sham组比显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；I/R 6 h+7NI 组GluR6的S-亚硝基化与I/R 6 h组相比显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；I/R 6 h+DMSO组GluR6 的S-亚硝基化与I/R 6 h组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；各处理组GluR6的蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图2）。

 

图2　脑缺血/再灌注通过nNOS诱导了KA受体GluR6的S-亚硝基化

存在于脑中的nNOS，脑缺血/复灌早期被持续激活并产生NO。有研究指出，NMDA型谷氨酸受体与PSD95和nNOS形成突触后蛋白复合体，促进了钙内流，并激活nNOS，从而产生NO［19-20］。研究指出，nNOS的活性受其磷酸化和巯基S-亚硝基化的调节［21-22］。本研究采用了nNOS的抑制剂7-NI来研究脑缺血/再灌注损伤中nNOS的作用，但是在脑缺血/再灌注中调节nNOS活性的上游信号通路尚待进一步研究。我室前期的研究已经证明脑缺血/再灌注能促进G1uR6· PSD95·MLK3信号模块的组装，并通过核通路和线粒体通路介导了海马CA1区神经元的凋亡，而给予GluR6-9c小肽或GluR6反义寡核苷酸能够通过下调GluR6、PSD95和MLK3三者的结合而起到对神经元的保护作用［5-6］。因此，考虑GluR6是可以受到调控的关键蛋白，而蛋白质活性氨基酸位点受到磷酸化或亚硝基化修饰后可以改变其活性，从而影响其下游的信号通路改变，本实验重点检测了GluR6的S-亚硝基化水平。

两种方法被用来检测蛋白质的S-亚硝基化，生物素转化法［17-18］和使用抗-SNO-Cys的抗体，这两种方法都已经得到了广泛的应用。在本研究中，这两种方法获得的结果一致，显示在脑缺血/再灌注早期，GluR6的S-亚硝基化水平显著升高，其可能的分子机制：在脑缺血/再灌注早期，nNOS来源的NO促进了GluR6的S-亚硝基化。GluR6 S-亚硝基化修饰后是否影响其介导的下游凋亡信号通路以及对神经元的凋亡的影响，以及GluR6 S-亚硝基化的活性半胱氨酸位点的鉴定，将是需要深入研究的内容，以为脑卒中的治疗提供新思路。

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Cerebral ischem ia-reperfusion induce G luR6 S-nitrosylation through neuronal NO synthase

WANGMei1HU Xiao-tong2QIDa-shi1WANG Lei2ZHANG Fang2▲
1.Laboratory of Morphology，Jiangsu Key Laboratory of Brain Disease Bioinformation，Xuzhou Medical University，Xuzhou 221004，China；2.Laboratory of Morphology，Xuzhou Medical University，Xuzhou　221004，China

[Abstract]Objective To discusswhether neuronal nitric oxide synthase induce KA receptor subunit GluR6 S-nitrosylation during ischemia-reperfusion.Methods 28 SD rats were randomly divided into 4 groups，each group had 7 rats：sham operation group，cerebral ischemia reperfusion 6 h combination with neuronal nitric oxide synthase inhibitor 7-NI group，cerebral ischemia reperfusion group，cerebral ischemia/reperfusion 6 h solvent control group.Transient cerebral ischemiawas induced by a four-vessel occluded　（4-VO）method.SD ratswere treated intraperitoneally with 7-Nitroindazole，an inhibitor of nNOS（7-NI，25mg/kg）.Biotin switch assay，SDS-PAGE and western blotwas performed to study S-nitrosylation and expression levels of GluR6.Results GluR6 S-nitrosylation levels in cerebral ischemia-reperfusion group increased significantly versus than that of sham group（P＜0.05）.GluR6 S-nitrosylation levels in cerebral ischemiareperfusion combination with neuronal nitric oxide synthase inhibitor 7-NI group descended significantly versus cerebral ischemia-reperfusion group，itwas significant difference　（P＜0.05）；however，GluR6 protein expression level was no significant difference among groups.Conclusion nNOS induce GluR6 S-nitrosylating during the early stages of ischemia-reperfusion，which can be a new theory basis for stroke therapy.

[Key words]Glutamate receptor 6；Cerebral ischemia reperfusion；S-nitrosylation；neuronal nitric oxide synthase

［中图分类号］R361+.3

［文献标识码］A

［文章编号］1674-4721（2016）09（c）-0149-04

（收稿日期：2016-04-26本文编辑：王红双）

［基金项目］国家自然科学基金青年基金项目（81500977）；江苏省高校自然科学研究面上项目（14KJB180022）；江苏省省级重点实验室开放研究课题（1505）；江苏省高校自然科学研究面上项目（13KJD310003）；江苏省徐州市科技计划项目（KC14SH076）

［作者简介］王梅（1982-），女，硕士，实验师，主要从事缺血性脑神经元损伤以及神经发育的研究

▲通讯作者：张芳（1971-），女，硕士，高级实验师，主要从事缺血性脑神经元损伤分子机制的研究