任丽娟1　刘亚丽2　侯嵋峰1　丁彦龙1

1.内蒙古自治区第四医院重症医学科，内蒙古呼和浩特　010080；2.武装警察部队内蒙古总队医院内一科，内蒙古呼和浩特　010041

［摘要］目的联合检测PTEN、p14ARF、Survivin在肺癌中的表达及相互关系，为肺癌诊断、监测发展及基因治疗提供理论依据。方法用免疫组织化学法检测2009年1月～2015年12月本院87例支气管肺癌组织和13例正常肺组织中PTEN、p14ARF、Survivin基因的表达及其相关性。结果PTEN、p14ARF表达在正常肺组织高于肺癌，而Survivin则相反；PTEN、p14ARF表达随肺癌细胞恶性程度增加而减少，而Survivin则相反，且在高、中、低分化各组间表达差异有统计学意义（P＜0.01）；在临床分期组随临床分期的增大，PTEN、p14ARF表达减少，而Survivin表达增强，且三者在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期表达比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。PTEN、p14ARF有协同作用（r=0.6489，P＜0.01），Survivin与PTEN，与p14ARF互为反作用（r=-0.5743，P＜0.01；r=-0.6860，P＜0.01）。结论PTEN、p14ARF和Survivin共同调控肺癌细胞的凋亡和增殖，为三者在肺癌中的联合治疗提供理论依据。

［关键词］肺癌；基因治疗；PTEN；p14ARF；Survivin；细胞周期；调亡

肺癌的发生、发展和基因治疗与细胞凋亡和增殖密切相关。细胞在进行增殖的同时，伴随细胞凋亡，调控他们之间的平衡是维持机体正常的生理功能和组织器官形态的基础。

PTEN是新近发现的第一个具有磷酸酯酶活性的肿瘤抑制基因，主要参与细胞增殖周期和凋亡中所发生的去磷酸化作用。p14ARF是新近发现的周期素依赖性激酶抑制蛋白，是直接调控细胞周期并且促进凋亡的抑癌基因。Survivin是凋亡抑制蛋白IAP家族成员之一，又名生存素，是新近凋亡抑制基因。三种基因蛋白在细胞周期调控和凋亡中具有相同作用通路，并且在肿瘤靶向治疗中已经成为研究热点，目前尚未对它们进行联合研究。所以本文用免疫组化方法检测PTEN、p14ARF、Survivin基因蛋白的表达及相关性，探讨其在肺癌发生、发展中的作用和临床意义。

1.1　材料

收集2009年1月～2015年12月在内蒙古医院及内蒙古第四医院病理科存档的肺癌蜡块87例和手术切除的正常肺组织13例，分别为支气管肺癌组和正常肺组织组。

1.2　方法

采用免疫组化S-P法测定PTEN、p14ARF和Survivin基因蛋白的表达。应用形态学显微图像分析系统对每张切片随机选取5个高倍视野，测其平均光密度值，取其平均值，采用平均光密度值代表各项指标的表达。

1.3　统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析。两独立样本根据方差齐性行T/T＇检验；多个样本均数行F检验，差别有统计学意义行两两比较多重极差检验；Survivin、PTEN、p14ARF之间的关系采用Pearson线性相关分析。

2.1　PTEN、p14ARF、Survivin基因在正常肺脏组织和支气管肺癌组织中的表达

正常肺脏组织中PTEN、p14ARF表达高于肺癌组织，而Survivin则相反。两组PTEN、p14ARF和Survivin比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1　PTEN、p14ARF、Survivin基因在正常肺脏组织和支气管肺癌组织中的表达

2.2　PTEN、p14ARF、Survivin基因在肺癌临床病理中的表达

组织学分型中PTEN、p14ARF、Survivin表达差异无统计学意义（P＞0.05）；在分化程度组随分化程度的降低，PTEN、p14ARF表达减少，Survivin表达增强，且在高、中、低分化各组间表达差异有统计学意义（P＜0.01）；在临床分期组随临床分期的增大，PTEN、p14ARF表达减少，而Survivin表达增强，三者且在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期间表达比较，差异有统计学意义（P＜0.01）（表2）。

表2　PTEN、p14ARF、Survivin在肺癌临床病理资料中的表达

 

与中分化组、低分化组两两比较，※P＜0.01；与低分化组比较，*P＜0.01。临床分期组中，PTEN、p14ARF：▲分别与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期比较，▲▲分别与Ⅲ、Ⅳ期比较，▲▲▲与Ⅳ期比较，均P＜0.01；Survivin：#与Ⅰ、Ⅱ期比较，##与Ⅰ期比较，均P＜0.01

2.3　PTEN、p14ARF、Survivin基因在肺癌组织中的相关分析

作Pearson线性相关分析得出，PTEN与p14ARF的表达相关系数为r=0.6489，Survivin与PTEN的表达相关系数为 r=-0.5743，Survivin与 p14ARF相关系数为r=-0.6860，差异有统计学意义（P＜0.01）（图1～图3）。

 

图3　p14ARF与Survivin相关关系

肺癌的发生、进展与细胞增殖和凋亡这两个紧密相连的细胞活动平衡相关联，干预细胞的增殖和凋亡目前已经成为基因治疗的基础［1-2］。

PTEN具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶的新型抑癌基因。PTEN蛋白的脂质磷酸酶活性通过磷酸化PIP3，负性调节PI3K/AKT/PKB信号通路。该信号通路在肿瘤发生发展、侵袭转移及细胞耐药中起重要作用。阻断凋亡相关蛋白天冬氨酸半胱氨酸酶capase家族的活化；阻断下游癌蛋白MDM2分子，使p53失活［3-4］，为当前肿瘤靶向治疗研究热点。傅玉峰等［5］通过质粒转染的方式，增加PTEN在肿瘤细胞中的表达，结果发现PTEN表达的增强抑制了耐药细胞在顺铂培养基中的生长，促进其凋亡。增加了耐药肿瘤细胞药物敏感性作用。刘琳等［6］在垂体腺瘤侵袭性研究中证实PTEN蛋白基因失活可能促进了肿瘤血管形成，有助于垂体腺瘤侵袭性。

p14ARF是位于INK4a-ARF基因位点CDKN2A的可变读框［7］。p14ARF与MDM2、p53形成复合物。结合MDM2减少p53被屏蔽于细胞核内被泛素化酶降解作用，使p53蛋白的半衰期延长，稳定p53水平加速MDM2降解发挥其抑癌效应，引起细胞周期阻滞于G1/G2期［8］。p14ARF与细胞周期素D（CyclinD）竞争结合并抑制CDK4/CDK6活性，使细胞分裂被阻滞于G1期［9］。由于p14ARF基因的cDNA长度短，便于基因克隆的操作，并具有显著的细胞周期负调控作用，是抑制肿瘤生长和提高肿瘤细胞对化疗药物敏感性的理想基因［10］。胡义德等［11］用p14ARF表达载体基因转染肺腺癌细胞系，可使肺腺癌细胞Tpot延长同时伴随G0/G1期和G2/M期细胞显著增加。张群华等用脂质介导方法将p14ARF基因转导至人胰腺癌细胞株，胰腺癌细胞得到很好控制。宋海峰等［12］扩增了Ad-p14ARF复制腺病毒导入在裸鼠皮下构建肝癌细胞株中的癌细胞凋亡，凋亡细胞比例与腺病毒滴度呈现一定的剂量相关性。

生存素Survivin其N末端含有凋亡抑制蛋白IAP重复序列（BIR）结构域，BIR分子中含有对凋亡有重要作用的氨基酸残基，Survivin通过这些残基与Caspase家族结合，抑制Caspases的活性，从而在上游阻断凋亡信号的传导，导致细胞在G2/M期凋亡，且与其他IAP比较具有更强的选择性［13］。此外，Survivin蛋白的C末端由42个氨基酸组成的两性α螺旋结构与细胞分裂微管蛋白结合，与抗凋亡活性紧密相关［14］。Survivin还与周期素依赖性激酶 4（CDK4）结合，使细胞分裂被阻滞于G1期［15］。在血管生成过程中，多种促血管生成因子如血管内皮生长因子等都能通过上调Survivin表达促进血管内皮细胞增殖。Survivin特异性调节细胞周期及控制凋亡，使其为解决肿瘤化学药物疗法特异性差、毒性强的缺点开辟了新的途径。Shapiro［16］将Survivin-CDKs抑制剂已用于临床肿瘤治疗，目前已进入Ⅱ期临床试验。Aggarwal等［17］Survivin反义寡核苷酸可下调Survivin mRNA表达，诱导凋亡，增加肺腺癌细胞对化疗药依托泊苷的敏感性。

综上所述，PTEN蛋白、Survivin蛋白、p14ARF蛋白在癌细胞周期及凋亡上存在共同作用途径。本实验经相关分析发现，Survivn与PTEN、p14ARF负相关，而且近年来在肿瘤治疗方面PTEN、p14ARF转基因治疗和反义Survivin基因治疗备受关注，并显示出良好的靶向性、特异性及安全性，本文为联合三种基因治疗提供了理论基础。PTEN、p14ARF、Survivin与肺癌临床病理关系紧密相连，认为这三种蛋白有望成为肺癌早期诊断的有效指标。

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Detection and genetic therapy significance of PTEN,p14ARFand Survivin in lung carcinoma

REN Li-juan1LIU Ya-li2HOU Mei-feng1DING Yan-long1
1.Department of ICU，Inner Mongolia Autonomy No 4 Hospital，Huhhot 010080，China；2.No 1 Department of Medicine，General Hospital of the Armed Police Force in Inner Mongolia，Huhhot 010041，China

[Abstract]Objective To study the expression and the relationship of PTEN，p14ARFand Survivin in lung carcinoma and offer more scientific theoretic basis for treatment and diagnosis of lung carcinoma.Methods 87 cases of primary bronchogenic carcinoma tissues and 13 cases normal lung tissues in our hospital from January 2009 to December 2015 were detected by SP immunohistochemical method，and their expression and correlation were studied.Results The positive expression of PTEN，p14ARFwere higher in normal lung tissue than primary bronchogenic carcinoma，the expression of Survivin was in contrast.The expression of PTEN，p14ARFwere reduced with poorly，moderately and welldifferentiated group，by contrast，the expression of Survivin was increasing（P＜0.01）.The expression of PTEN，p14ARFwere reduced，while the expression of Survivin was increasing with clinical stages enlarging in clinical stages group，PTEN，p14ARFand Survivin among stageⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳhad statistical difference（P＜0.01）.Among PTEN，p14ARFand Survivin were correlatively analyzed in lung carcinoma.There is a positive correlation between PTEN and p14ARF（r=0.6489，P＜0.01），with negative correlation between Survivin and PTEN（r=-0.5743，P＜0.01）or Survivin and p14ARF（r=-0.6860，P＜0.01）.The three gene are associated with the primary bronchogenic carcinoma.Conclusion PTEN，p14ARF，Survivin play a combined role in the apoptosis and proliferation of primary bronchogenic carcinoma.It is important to improve our treatment and diagnosis of primary bronchogenic carcinoma.

[Key words]Lung carcinoma；Genetic therapy；PTEN；p14ARF；Survivin；Cell cycle；Apoptosis

［中图分类号］R734.2

［文献标识码］A

［文章编号］1674-4721（2016）09（c）-0011-04

（收稿日期：2016-07-05本文编辑：方菊花）