血管生成素-1对脂多糖所致肺损伤和炎症反应的影响
王莹
河南大学第一附属医院麻醉科，河南开封475000
［摘要］目的 探讨血管生成素-1（Ang-1）在脂多糖所致肺损伤和炎症反应中的保护作用。方法 将30只雄性KM小鼠随机分为对照组，LPS组，Ang-1组，每组10只，经气管内滴入脂多糖构建急性肺损伤（ALI）模型，建模前24 h经尾静脉注入带绿色荧光蛋白的重组腺病毒 （Ad-GFP，LPS组）或带人Ang-1的重组腺病毒 （Ad-GFP-Ag-1，Ang-1组），对照组给予等量生理盐水。建立ALI 24 h后处死全部小鼠，测定肺湿干比，观察组织形态学变化，酶联免疫吸附试验检测血清白细胞介素-6（IL-6）水平及肺泡灌洗液中粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）水平。结果Ang-1组肺湿干比为4.05±0.16，明显低于LPS组的5.46±0.07；Ang-1组血清IL-6水平为（173.07±10.05）ng/ml，明显低于LPS组的（324.61±8.92）ng/ml；Ang-1组肺泡灌洗液GM-CSF水平为（15.05±1.21）ng/ml，明显高于LPS组的（10.24±1.35）ng/ml；与LPS组比较，Ang-1组的肺组织病理学损伤明显减轻。结论Ang-1能减轻LPS所致的肺组织损伤和炎症反应。
［关键词］血管生成素-1；肺损伤；脂多糖；炎症反应
急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是各种直接或间接因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致急性低氧性呼吸功能不全。ALI过程中伴随有单核细胞浸润、中性粒细胞凋亡，巨噬细胞吞噬等过程［1］。除此之外，ALI的发展过程还伴随内皮细胞的激活和损伤。ALI中内皮细胞是受损的主要靶细胞，内皮细胞损伤是ALI的重要标志，在疾病复杂的病理机制中，内皮细胞的活化与损伤起重要作用，其程度与预后密切相关。血管生成素-1（Ang-1）属于血管生成素家族成员，其通过与血管内皮细胞和造血干细胞上的酪氨酸蛋白激酶受体2（Tie-2）结合，并使Tie-2受体快速磷酸化而促进血管内皮细胞的移行与存活［2］。在内毒素性肺损伤中，通过增加Ang-1的方法可有效抑制血管内皮细胞活化、损伤，减少内皮细胞相关黏附分子表达，降低肺血管通透性，抑制炎性细胞浸润，并提高ALI小鼠存活率。因此表明，Ang-1可以稳定血管内皮细胞，在炎症的发生阶段有着很好的抗炎作用［3］，但是对炎症消退的影响尚不清楚。本研究通过气管内滴入脂多糖制作急性肺损伤小鼠模型，取肺泡灌洗液和血液，离心并测定炎症因子，测定肺湿干比，HE染色观察肺损伤情况，以探讨Ang-1是否能够进一步减轻肺损伤和促进炎症消退。
1 材料与方法
1.1 实验动物及试剂
选择18～22 g的清洁级KM小鼠，购自河南省动物实验中心，小鼠许可证号SCXK（豫）2010-0002。动物饲料20 kg，供自河南省动物实验中心。所有实验动物饲养于河南大学第一附属医院肿瘤分子免疫实验室，环境清洁，温度17～23℃，相对湿度45%～55%，光照随昼夜变化，自由饮水、摄食。
携带人Ang-1的重组腺病毒购自郑州赛斯生物科技有限公司，滴度为1012PFU/ml；IL-6和GM-CSF试剂盒购自郑州赛斯生物科技有限公司；戊巴比妥钠，规格：5 g，购于北京普博斯生物科技有限公司。
1.2 模型构建及分组
对照组10只，经尾静脉注入携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒（Adenoviral-GFP）109PFU，24 h后经口气管插管滴入生理盐水2μl/g。
LPS组10只，经尾静脉注射携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒（Adenoviral-GFP）109PFU，24 h后经口气管插管滴入1.5mg/ml LPS 2μl/g。
Ang-1组10只，经尾静脉注射携带人血管生成素1的重组腺病毒（Adenoviral-Ang-1）109PFU，24 h后经口气管插管滴入1.5mg/ml LPS 2μl/g。
1.3 实验方法
于脂多糖应用后24 h用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（10 g/kg），麻醉后将小鼠四肢固定于手术台上，在大鼠颈部切开一个长约1 cm的切口，用镊子沿皮下钝性分离充分暴露出气管，用20m l空针针头在气管3～4软骨环之间沿气管插入，用丝线结扎并固定，并用丝线结扎右侧主支气管。
1.4 检测指标
1.4.1 血清白细胞介素-6（IL-6）浓度 于LPS应用后24 h尾静脉采血，4℃下2000 r/min离心15min，收集血清，-80℃保存。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测血清中IL-6的浓度。
1.4.2 肺泡灌洗液中粒-巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）浓度 用0.8ml的生理盐水行左侧肺泡灌洗，共3次，离心收集肺泡灌洗液，4℃下2000 r/min离心15 min，取上清液，-80℃保存，双抗体夹心酶联免疫吸附法检测肺泡灌洗液中GM-CSF的浓度。
1.4.3 肺湿干重比值测定 取右肺下叶，滤纸擦干表面，立即称重记为肺湿重，然后置入70℃烘箱中干燥至重量恒定，再次称重为肺干重，计算两次肺组织重量之比，即肺组织的湿干比。
1.4.4 肺组织学改变 取右肺上叶肺组织，经4%多聚甲醛固定后常规石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察肺组织学变化。参照相关文献［4］对肺泡、间质炎症性改变、出血、肺不张和肺水肿形成分别进行评分。
1.5 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（
）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。2 结果
2.1 各组血清IL-6水平和肺泡灌洗液中GM-CSF水平的比较
LPS组和Ang-1组血清IL-6水平明显明显高于对照组 （P＜0.05）；Ang-1组血清IL-6水平明显高于LPS组（P＜0.05）。LPS组和Ang-1组GM-CSF水平明显高于对照组（P＜0.05）；Ang-1组GM-CSF的水平明显高于LPS组（P＜0.05）（表1）。
表1 各组血清IL-6水平和肺泡灌洗液中GM-CSF水平的比较
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与对照组同指标比较，*P＜0.05；与LPS组同指标比较，#P＜0.05
2.2 各组肺湿干比的比较
对照组肺湿干比为3.15±0.27，LPS组为5.46± 0.07，Ang-1组为4.05±0.16。LPS组肺湿干比较对照组明显增加（P＜0.05）；Ang-1组的肺湿干比显著低于LPS组（P＜0.05）。
2.3 肺组织学改变
对照组：肺脏光镜下肺组织结构清楚，肺泡腔清晰，肺泡壁及间质基本无水肿、炎症等特殊改变；LPS组：部分肺泡萎陷，肺泡壁通透性增加，可见较多中性粒细胞及少许巨噬细胞浸润，肺泡间隔增宽，肺泡及间质明显水肿；Ang-1组：可见肺泡轻度肺水肿，肺间质充血、水肿明显减轻，肺泡和肺间质中性粒细胞浸润减少（图1）。肺组织病理学评分：对照组为（0.35± 0.17）分，LPS组为（4.46±0.27）分，Ang-1组为（2.05± 0.16）分。LPS组、Ang-1组评分明显高于对照组，LPS组评分明显高于Ang-1组，差异有统计学意义 （P＜0.05）。
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图1 肺组织学改变（HE 10×10）
3 讨论
Ang是一类在血管内皮细胞内表达的具有促血管内皮生长作用的细胞因子，主要发挥组织修复及维持血管内皮细胞完整性的作用。Ang共分为四个亚型Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4。其中Ang-1作用于肺血管，促进成熟而有空间结构的血管网的形成。Ang-1的功能主要有抑制血管内皮细胞的凋亡，促进内皮细胞出芽、迁徙和成熟，抗炎、维持血管稳定和抗血管渗漏等作用。
在ALI中，Ang-1的表达对调控维持肺毛细血管的稳定起着重要作用。本研究显示，LPS组和Ang-1组中IL-6水平明显高于对照组，Ang-1组中IL-6水平明显高于LPS组。另有研究表明，改良的Ang-1分子在LPS诱导脓毒症小鼠模型中可以减少IL-1β、IL-10以及IL-1的生成［5］。因此，Ang-1可以减少LPS所致ALI过程中炎症因子的产生，减少炎症反应，因而对LPS所致的肺损伤有保护作用。
GM-CSF由活化的内皮细胞、巨噬细胞和T细胞分泌。体外研究发现，GM-CSF是一个重要的延迟中性粒细胞凋亡分子［6-7］。本研究显示，LPS组和Ang-1组中GM-CSF水平明显明显高于对照组，且Ang-1组中GM-CSF的水平明显高于LPS组。Ang-1对GM-CSF浓度的影响可能是由于活化的内皮细胞和巨噬细胞在炎症的起始阶段释放GM-CSF。临床研究显示，对于急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的患者，肺泡灌洗液中GM-CSF浓度高的患者预后更好［7］。可见，升高的Ang-1对LPS所致ALI是有利的。
肺组织湿干比是常用的反映肺组织的含水量以及及肺水肿程度的指标。本研究显示，与对照组相比，LPS组肺湿干比明显增加，而Ang-1组中肺湿干比显著低于LPS组。这可能是由于Ang-1的表达增多，毛细血管的渗出减少，减轻炎症所致的肺间质水肿以及红细胞漏出。Akeson等［8］认为，Ang-1有效防止血浆外漏，还能抑制由诱发血管渗漏导致的组织水肿。另有研究显示，在肺部，LPS诱导Ang-1和Ang-4的下调，致使肺组织毛细血管通透性增加、炎症细胞浸润而诱发肺损伤，而给予Ang-1基因治疗可以减弱LPS诱导的小鼠肺损伤，减轻肺水肿［9］。
本研究显示，给予外源性Ang-1可以减轻ALI的肺组织病理学损伤，并且肺组织评分也得到了改善。在内毒素或过氧化氢诱导的肺损伤模型中，给予外源性Ang-1、接受Ang-1基因治疗或使Ang-1基因过度表达的小鼠的肺中性粒细胞浸润减少、血管通透性降低［10-13］。另外，在腹腔注射LPS所诱导的内毒素性休克小鼠模型中，组织学观察也发现，转染了Ang-1的小鼠肺损伤明显减轻［14］。郭强等［15］也发现，注射重组Ang-1能使小鼠急性肺损伤程度有所减轻。因此，经Ang-1预处理能显著减轻肺组织病理学损伤。
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Effects of Angiotensin-1 on lung injury and inflammatory pesponses induced by lipopolysaccharide
WANG Ying
Department of Anesthesia，the First Affiliated Hospital of Henan University，Kaifeng 475000，China
Department of Anesthesia，the First Affiliated Hospital of Henan University，Kaifeng 475000，China
［Abstract］Objective To investigate the protective effects of application of Angiotensin-1（Ang-1）on lung injury and inflammatory responses induced by lipopolysaccharide（LPS）.Methods Altogether 30male KM mice were randomly divided into three groups（control group，LPSgroup and Ang-1 group），with 10mice in each group.Intratracheal instillation of LPSwas performed so as to constructan acute lung injury（ALI）model.Either recombinant adenovirus-green fluorescent protein（LPSgroup）or recombinant adenovirus-human angiotensin 1 was intravenously injected intomice by vena caudalis 24 h beforemodeling；control group was given normal saline.All themice were sacrificed 24 h after the establishment of ALI so as to determine the Wet-Dry（W/D）ratio of lung，the histological changes of lung tissues was observed and serum interleukin-6（IL-6）level and granulocytemacrophage-colony stimulating factor（GM-CSF）level in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）according to ELISA were detected.Results TheW/D ratio of lung and serum IL-6 level of Ang-1 group were（4.05±0.16）and（173.07±10.05）ng/ml，significantly lower than（5.46±0.07）and（324.61± 8.92）ng/ml in LPS group；the GM-CSF level in BALF of Ang-1 group was（15.05±1.21）ng/ml，significantly higher than that in LPSgroup（10.24±1.35）ng/ml.At the same time，the pathological injury of lung tissues in Ang-1 group was significantly reduced compared with LPS group.Conclusion Ang-1 can reduce the lung tissue damage and inflammatory responses induced by LPS.
［Key words］Angiotensin-1；Lung injury；Lipopolysaccharide；Inflammatory responses
［中图分类号］R563［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）09（a）-0019-04
（收稿日期：2016-06-30本文编辑：王红双）
［基金项目］河南省科技厅科技计划项目（142300410129）
［作者简介］王莹，硕士研究生导师，副主任医师