类泛素蛋白FAT 10在肝癌中的表达及生物学作用
白东
沈阳医学院附属中心医院普外三科，辽宁沈阳110024
［摘要］目的　探讨类泛素蛋白FAT10在肝癌细胞中的异常表达和功能活化及其分子机制。方法　将38例肝癌大鼠随机分为空白组、pcDNA3.1-FAT10组、FAT10 siRNA组。采用RT-PCR法检测肝癌及癌旁组织中FAT10mRNA的表达水平，电穿孔法分别将FAT10 siRNA和重组表达载体pcDNA3.1-FAT10转染人肝癌SMMC-7721后，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡的变化，RT-PCR检测PI3K/Akt通路的变化。结果FAT10mRNA在大鼠肝癌组织中的相对表达水平明显高于癌旁组织（P＜0.05），沉默FAT10后，对细胞周期无明显影响，细胞凋亡率上升，PI3K/Akt信号通路表达下调；促进FAT10表达后，对细胞周期无明显影响，细胞凋亡率显著下降，PI3K/Akt通路表达上调。结论FAT10可通过上调PI3K/Akt通路表达，减少细胞凋亡，增强肝癌细胞的侵袭能力，FAT10可能成为预防和治疗肝癌的靶点。
［关键词］肝癌；FAT10；电转法；PI3K/Akt信号通路；凋亡
肝癌因其存活率低，发病率高，已成为众多学者关注的对象［1-3］。类泛素是与泛素具有相似功能的蛋白，在结构上与泛素具有部分相同序列。FAT10是一种新发现的，可以通过共价结合发挥泛素样作用的类泛素蛋白［4-6］。其在多种癌细胞如胃肠癌、肝癌等细胞中得以表达［7-10］。因此，本实验先对肝癌及癌旁组织的FAT10进行检测，后将FAT10 siRNA和重组表达载体pcDNA3.1-FAT10转染肝癌细胞，采用多种方法分别检测细胞周期和细胞凋亡的变化，RT-PCR检测PI3K/Akt通路的变化，旨在为肝癌的治疗提供新的手段。
1　资料与方法
1.1　一般资料
设计：随机对照动物实验。
时间及地点：2014年9月～2015年12月在沈阳医学院实验室完成。
材料及来源：SMMC-7721细胞株购于上海誉贸实业有限公司，由本实验室保存。L-DMEM培养基、胎牛血清和混合抗生素购自GIBCO公司，FAT10 siRNA和重组表达载体pcDNA3.1-FAT10均由上海吉玛公司合成，电穿孔仪，TRIzol Reagent购自Invitrogen公司，CCK-8试剂盒购于上海Dojind化学科技有限公司，流式细胞仪购于赛默飞公司，多克隆兔抗体Akt购于Proteintech公司，GAPDH抗体购于Bioworld公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体购自优维宁生物技术公司。
1.2　RT-PCR检测FAT10表达
38例肝癌大鼠开腹，取少量肝癌及癌旁组织粉碎后，加入含1 mg/ml亚铁离子的PBS多次反复冲洗，用匀浆器打匀，并过100mm滤膜，备用。吸取2μl的悬浮细胞液，正反向引物各加入1μl悬浮细胞液。反应循环条件如下：95℃变性5 min，95℃退火30 s，56℃30 s，72℃30 s，45循环，最终72℃延伸7 min。将PCR产物10μl于1.2%琼脂糖凝胶电泳30 min，采用凝胶自动成像及分析系统，电泳结果用凝胶图像分析系统分析电泳条带光密度值，计算光密度与GAPDH的光比值。
1.3　流式细胞术检测细胞周期和凋亡
未经任何处理的肝癌细胞为空白组。转染FAT10 siRNA（FAT10 siRNA组）和重组表达载体pcDNA3.1-FAT10（pcDNA3.1-FAT10组）48 h后，收集各组细胞，37℃下，0.25%胰酶消化，1500 r/min，离心10 min，去上清，PBS洗涤3次，重悬细胞浓度为1×106/ml。移液枪取100μl的细胞于流式管中，缓慢加入70%的乙醇溶液，同时用移液枪移取100μl的细胞于另一组流式管中，缓慢加AnnexinV-FITC溶液，两组流式管4℃下充分振荡，并静置24 h，1000 r/min离心10min后，除去细胞固定液，PBS溶液洗涤多次，加入100μl，200μg/ml 的RNA酶溶液，室温静置1 h，加入50μg/ml的PI液染色，0.5 h后流式细胞仪测定细胞周期和凋亡。
1.4　RT-PCR检测PI3K/Akt信号通路
按TRIzol Reagent说明书提取各组细胞总RNA，以总RNA mRNA为模板，反转录合成cDNA，在扩增仪上进行RT-PCR。正反向引物各加入1μl悬浮细胞液FAT10的上游为：5′-AATACCTGGTGTCGGTCTCA-3′，下游为：5′-TCGAGCTCATCCTAATGGAG-3′，扩增目的基因片段长度为210 bp。内参GAPDH的上游为：5′-TCCCATCACCATCTTCCAG-3′，下游为：5′-AGGAGTGGGTGTCGCTG-3′，目的基因扩增长度为350 bp。反应条件：95℃变性5 min，95℃退火30 s，61.5℃30 s，72℃30 s，30循环，72℃延伸10 min。将PCR产物10μl于1.2%琼脂糖凝胶电泳30 min，结果用凝胶图像分析系统分析，计算光密度与GAPDH的光比值。
1.5　统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，计量数据以平均数±标准差表示，采用t检验，多组间的数据比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　FAT10在肝癌及癌旁组织中的表达
肝癌组织中FAT10的表达水平明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

 
图1　FAT10 m RNA电泳表达
2.2　细胞周期及凋亡
沉默FAT10表达，FAT10 siRNA组细胞周期无明显变化，细胞凋亡率明显升高。促进FAT10基因表达，细胞周期无明显改变，细胞凋亡率降低，但仍高于基因沉默癌细胞FAT10表达后的细胞凋亡率，各组比较差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。
表1　各组细胞周期分布及细胞凋亡情况比较

 
与FAT10 siRNA组比较，*P＜0.05；#P＜0.05
2.3　Hsp90/Akt信号通路变化
沉默癌细胞FAT10表达后，PI3K/AktmRNA信号通路与未转染的SMMC-7721相比表达下调，促进FAT10细胞表达，PI3K/AktmRNA信号表达最高，重组表达载体pcDNA3.1-FAT10转染的SMMC-7721细胞PI3K/AktmRNA信号表达介于两者之间，各组比较差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

 
图2　各组PI3K/Akt信号通路m RNA表达
3　讨论
类泛素蛋白对肝癌的转化、增殖和化疗敏感性有很强的调节作用［11-14］。PI3K/AKT的信号调节对细胞自噬具有抑制作用，体内特定因子结合相应受体，激活PI3K，促进AKT的磷酸化，降低GTP酶活性，对自噬负向调节［15］。
本研究首先检测了肝癌及癌旁组织的FAT10 mRNA水平，结果显示，肝癌组织中的FAT10 mRNA表达远高于癌旁组织，可见FAT10与癌症的形成有关。进一步研究发现，转染了FAT10 siRNA的SMMC-7721增殖活性显著降低，远低于基因促进FAT10表达后的肝癌细胞增殖活性，推测FAT10在肝癌细胞异常增殖中发挥作用。研究发现，FAT10的沉默或促进表达对细胞周期影响甚微，对细胞凋亡率及侵袭能力起关键作用。FAT10沉默后，细胞凋亡率和侵袭能力明显低于FAT10促进表达的细胞凋亡，可见FAT10是通过影响细胞凋亡发挥作用的。对于其机制的探索，本实验采用RT-PCR检测PI3K/Akt信号通路的变化，PI3K/Akt信号通路表达下降，可见自噬得到促进，起到抑制癌细胞作用，而在基因促进癌细胞的PI3K/Akt信号通路，表达明显上调，抑制细胞自噬现象，癌细胞得以扩增。
本研究结果显示，抑制FAT10基因，肝癌细胞增殖、凋亡等方面都会得到抑制，FAT10的作用机制与PI3K/Akt信号通路表达相关，FAT10可促进PI3K/Akt信号通路的表达。
［参考文献］
［1］Um TH，Kim H，Oh BK，et al.Aberrant CpG island hypermethylation in dysplastic nodules and early HCC of hepatitis B virus-related human multistep hepatocarcinogenesis［J］.J Hepatol，2011，54（5）：939-947.
［2］Liu W，He F，Jiang Y.Network-based discovery of gene signature for vascular invasion prediction in HCC［J］.JHepatol，2012，56（6）：1420-1429.
［3］Xiaojian H，Min C，Tao H.Lentivirus-mediated RNAi knockdown of the gap junction protein，Cx43，attenuates the development of vascular restenosis following balloon injury［J］. Int JMolMed，2015，35（4）：885-892.
［4］Marrero JA.Multidisciplinary management of hepatocellular carcinoma：where are we today？［J］.Semin Liver Dis，2013，33（Suppl 1）：3-10.
［5］Wang C，Zhang Z，Li L，et al.S100A11 is amigration-related protein in laryngeal squamous cell carcinoma［J］.Int J Med Sci，2013，10（11）：1552-1559.
［6］张春阳，王娟，王星，等.FAT10在乳腺癌中的表达及其临床病理意义［J］.现代预防医学，2015，42（6）：1009-1011.
［7］袁荣发，余新，刘天德，等.FAT10基因在肝细胞癌中的表达和突变分析［J］.天津医药，2012，40（9）：873-875.
［8］Bedford L，Lowe J，Dick LR，et al.Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets［J］.Nat Rev Drug Discov，2011，10（1）：29-46.
［9］Schmidtke G，Aichem A，Groettrup M.FAT10ylation as a signal for proteasomal degradation［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1843（1）：97-102.
［10］支修益，吴一龙，马胜林，等.原发性肺癌诊疗规范［J］.中国肺癌杂志，2012，15（12）：677-688.
［11］Zhao Y，Brickner JR，Majid MC，et al.Crosstalk between ubiquitin and other post-translational modifications on chromatin during double-strand break repair［J］.TrendsCell Biol，2014，24（7）：426-434.
［12］胡威，董忠谊，吴德华，等.FAT10通过激活RhoA介导肝细胞性肝癌侵袭转移［J］.中国肿瘤临床，2015，42（14）：689-694.
［13］Wang J，Cai S，Chen Y.Mechanism of E1-E2 interaction for the inhibition of Ubl adenylation［J］.JBiol Chem，2010，285（43）：33457-33462.
［14］晏琛，邵江华.类泛素蛋白与肝癌［J］.中国肿瘤临床，2014，41（14）：933-937.
［15］Zhang ZY，Wu YQ，Luo H，et al.The effect of nuclear factor of activated T-cells（NFAT）in kidney I/R mediated by C5a/C5aR［J］.Int JClin Exp Med，2015，18（9）：15535-15541.
Expression and biological function of ubiquitin-like protein FAT10 in liver cancer
BAIDong
The Third Department of General Surgery，Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China
 
［Abstract］Objective To investigate the ubiquitin protein FAT10 abnormal expression in hepatoma cells and activation of function and its molecular mechanism.Methods 38 cases of liver cancer rats were randomly divided into blank group，pcDNA3.1-FAT10 group，FAT10 siRNA group.The expression level of FAT10 mRNA was detected by RT-PCR method.After respectively FAT10 siRNA and pcDNA3.1-FAT10 recombinant expression vector transfected into human hepatoma SMMC-7721 cells by electroporation，and flow cytometry to detect cell cycle and apoptosis，RT-PCR detection of PI3K/Akt pathway.Results FAT10 mRNA in rats hepatocellular carcinoma relative expression levels were significantly higher than adjacent tissues（P＜0.05），after gene silencing in cancer cells FAT10 expression of cell cycle distribution had no significant impact on the rate of increase in apoptosis，PI3K/Akt path expression signals down；after FAT10 promote gene expression in cells，no significant effect on the cell cycle，apoptosis was significantly decreased，PI3K/Akt pathway upregulation.Conclusion FAT10 can increase the expression of PI3K/Akt pathway signal，reduce apoptosis，enhanced invasive ability of liver cancer cells，FAT10may become targets for prevention and treatment.
［Key words］Liver cancer；FAT10；Electroporationmethod；PI3K/Akt signaling pathway；Apoptosis
［中图分类号］R735.7
［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）09（a）-0016-03
（收稿日期：2016-05-07本文编辑：王红双）