内质网源性转录因子对间歇性低氧大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响
王媛媛1　曹　建2▲　万建华3
1.南昌市第三医院心内科，南昌　330009；2.南昌大学第二附属医院麻醉科，南昌　330006；3.江西省景德镇市中医院麻醉科，江西景德镇　333000
［摘要］目的 研究内质网源性转录因子（CHOP）对间歇性低氧大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响。方法 54只大鼠随机分为三组：假手术组（n=18）、缺血再灌注组（n=18）、间歇性低氧+缺血再灌注组（n=18）。通过球囊结扎冠状动脉方法制作心肌缺血再灌注动物模型，将老鼠暴露在低氧循环中。制作间隙性低氧动物模型，用TUNEL法检测心肌细胞的凋亡，术后Western blot法检测CHOP蛋白表达。结果 假手术组、缺血再灌注组及间歇性低氧+缺血再灌注组的心肌细胞凋亡率分别为（4.16±2.27）%、（38.68±4.58）%、（18.72±6.71）%，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）；假手术组、缺血再灌注组及间歇性低氧+缺血再灌注组的CHOP蛋白表达分别为（1.612±0.284）%、（0.946± 0.372）%、（0.547±1.429）%，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 间歇性低氧在大鼠心肌缺血损伤中具有保护心脏的作用，其保护机制与CHOP蛋白表达下降有关。
［关键词］内质网源性转录因子；间歇性低氧；缺血再灌注
低氧是心肌缺血的主要因素，在缺血性心脏疾病中有重要的作用。低氧损伤的严重程度除了与低氧刺激的强度和持续时间有关，同时与心脏对低氧的耐受性有关［1-2］。因此，增加心脏对缺血、缺氧的耐受性来达到心脏保护的目的，一直是基础和临床医学研究关注的热点之一。本实验在研究间歇性低氧状态下，内质网源性转录因子（CHOP）表达对心肌缺血再灌注损伤的作用机制。现报道如下。
1　材料与方法
1.1　实验动物及试剂材料
取8～10周左右雄性SD大鼠54只，体重（200± 20）g，由南昌大学动物实验中心提供。TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒（武汉博士德公司）；蛋白浓度测定标准品 （普利莱公司）；兔抗大鼠CHOP抗体 （美国Bioword公司），碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗兔IgG（美国Santacruz公司），BX41型光学显微镜 （日本奥林巴斯株式会社）。
1.2　动物分组及模型建立
将实验动物分为三组。
假手术组（n=18）：含氧量正常者作为假手术组［3］，丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎，经尾静脉注射生理盐水。
缺血再灌注组（n=18）：参考赵秀梅等［4］的垫扎球囊法，采用气管插管、人工呼吸、开胸、冠状动脉左前降支上垫扎充水球囊阻断血流的方法造成心肌缺血，通过塌陷气囊进行心肌再灌注，复制并制作大鼠缺血再灌注模型。
间歇性低氧+缺血再灌注组（n=18）：将大鼠暴露在每日4次的低氧循环中 （每次接受2min 6%～8%低氧，3min氧和处理，循环5次），处理14 d，制作间歇性低氧模型。建立间歇性低氧动物模型后，再制作缺血再灌注模型。
1.3　 TUNEL法检测心肌细胞凋亡
通过末端缺口标记技术（terminaldeoxy-nucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）测定凋亡细胞。试验结束后将心肌组织石蜡切片，按TUNEL试剂盒说明书标记染色。未凋亡的细胞核为深蓝色，凋亡的细胞核为棕黄色。在高倍镜下随机选择10个视野，每个视野中选100个细胞，统计阳性细胞数。将阳性细胞数相加，计算阳性细胞百分率。
1.4　W estern blot法检测CHOP蛋白表达
制模结束后处死手术处理后的存活大鼠。采用Western blot方法测定CHOP蛋白，提取各组心肌组织，采用考马斯亮蓝测定蛋白质定量。蛋白变性后，将含有20μg蛋白的样本进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，再将凝胶上的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，封闭液封闭，用特异性CHOP抗体孵育，4℃过夜，然后与辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，增强化学发光法显色［4］。以β-actin作为蛋白质完整性及等量的对照。
1.5　统计学分析
采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较应用单因素方差分析，组间两两比较应用q检验。非正态分布数据经校对转换为正态数据后进行统计。计数资料以率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　各组大鼠心肌细胞凋亡率的比较
TUNEL法检测显示，凋亡心肌细胞核为棕黄色，染色质凝聚、浓缩，而正常心肌细胞的核染为蓝色。假手术组凋亡的细胞极少；缺血再灌注组见一定量的凋亡细胞；间歇性低氧+缺血再灌注组可见少量凋亡细胞，各组大鼠心肌细胞凋亡率为（4.16±2.27）%、（38.68± 4.58）%、（18.72±6.71）%，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.2　各组心肌组织CHOP蛋白表达的比较
Western blot法检测各组心肌组织CHOP蛋白水平，假手术组、缺血再灌注组、间歇性低氧+缺血再灌注组CHOP蛋白表达分别为（0.162±0.284）、（0.946± 0.372）、（0.547±1.429），与假手术组比较，间歇性低氧组CHOP蛋白表达明显下降（P＜0.05）；与缺血再灌注组比较，间歇性低氧组CHOP蛋白表达明显下降（P＜0.05）；与假手术组比较，间歇性低氧+缺血再灌注组CHOP组蛋白表达升高（P＜0.05）。
3　讨论
心肌缺血再灌注损伤指在短时间心肌血液供应中断，一定时间内恢复血供，原缺血心肌发生更严重的损伤。早期流行病学调查和动物实验发现，低氧适应可以增加心脏对缺血缺氧损伤的保护作用［5-9］，然而目前间歇性低氧的心肌保护作用机制的研究还是非常匮乏。
间歇性低氧适应类似缺血预适应，具有较明显的心脏保护作用，可以增强心肌对缺血再灌注损伤的耐受性，减轻细胞凋亡，限制心肌梗死面积，抗心律失常，以及促进缺血再灌注心脏舒缩功能的恢复［10-13］。本实验建立间歇性低氧模型，发现间歇性低氧预处理可以减轻心肌缺血再灌注损伤。
CHOP是一种内质网应激特异性转录因子，在哺乳动物细胞中广泛表达，是内质网应激信号途径中非常重要的调控因子之一，也是内质网应激与细胞凋亡之间存在的重要信号分子［14-16］。生理状态下，细胞胞浆中有低水平表达CHOP，在内质网应激时，表达明显增加。可以从胞浆向胞核转移，同时调控其他基因表达［17-19］。
本实验通过检测低氧处理后各组细胞凋亡率及CHOP蛋白表达，通过Western-blot检测，发现假手术组CHOP蛋白含量及心肌凋亡率较低；缺血再灌注组CHOP蛋白及心肌细胞凋亡率明显升高；间歇性低氧+缺血再灌注组较缺血再灌注组CHOP蛋白含量下降，心肌凋亡率下降，提示间歇性低氧处理后，低氧可以减少缺血再灌注后CHOP蛋白表达，CHOP蛋白在内质网应激中能诱导细胞周期阻滞，同时通过多种途径促进心肌细胞发生凋亡，CHOP蛋白表达下降，进而心肌细胞凋亡减少，最终达到保护心肌缺血再灌注损伤的目的，其内在机制值得进一步探讨与研究。
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Effect of C/EBP homologous protein （CHOP）on heart ischemicmyocardial damage in intermittent hypoxia
WANG Yuan-yuan1　CAO Jian2▲　WAN Jian-hua3
1.Department of Cardiology，the Third Hospital of Nanchang，Nanchang　330009，China；2.Department of Anesthesiology，the Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang　330006，China；3.Department of Anesthesiology，Jingdezhen Hospital of Traditional Chinese Medicine in Jiangxi Province，Jingdezhen　333000，China
［Abstract］Objective To investigate effect of C/EBP homologous protein　（CHOP）on heart ischemicmyocardial damage in intermittent hypoxia.Methods Fifty-four rats were randomly divided into 3 groups:sham-operated group（n=18），myocardial ischemia reperfusion group（I/R）（n=18），intermittent hypoxia+I/R group（n=18）.I/Rmodelwas established by ligating the left anterior descending coronary artery，mice were exposed to intermittent hypoxia cycles to establish the IH model，TUNEL was used to detect the cardiacmyocyte apoptosi，the expression of CHOP was analyzed by Western blot. Results The apoptosis rate of sham-operated group，the I/R group，I/R+intermittent hypoxia group was　（4.16±2.27）%，（38.68±4.58）%，（18.72±6.71）%respectively，there was significant difference between the groups（P＜0.05）.The expression of CHOP of sham-operated group，the I/R group，I/R+intermittent hypoxia group was（1.612±0.284）%，（0.946±0.372）%，（0.547±1.429）%respectively，there was significant difference between the groups（P＜0.05）.Conclusion IH is crucial for the cardioprotection against I/R，the protectivemechanism may be related to the decrease of CHOP expression.
［Key words］C/EBP homologous protein；Intermittent hypoxia；Ischemia/reperfusion
［中图分类号］R692.5
［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）08（c）-0145-03
（收稿日期：2016-06-20本文编辑：卫　轲）
［基金项目］江西省卫生计生委科技计划项目（20155210）
▲通讯作者