白藜芦醇预处理对急性乙醇暴露的斑马鱼幼鱼行为的影响
陈昊珺1 林 佳2 李 强2 郭 宁1▲
1.上海中医药大学中医方证与系统生物学研究中心，上海 201203；2.复旦大学附属儿科医院儿科研究所复旦大学儿童发育与疾病转化医学研究中心-上海市出生缺陷防治重点实验室，上海 201102
［摘要］目的 探讨不同光照条件下白藜芦醇预处理对不同浓度急性乙醇暴露的斑马鱼幼鱼行为的影响。方法 取成功脱模的第0天野生型AB品系斑马鱼鱼卵300颗，均分为两组，分别用系统水和白藜芦醇处理4 d。第5天时每组再分为4个小组（每个小组36颗），分别暴露在不同浓度的乙醇中（0.0%、0.5%、1.0%、2.0%），在光照和黑暗环境中，记录斑马鱼幼鱼每分钟的游动距离，并用双因素方差分析处理数据。结果 黑暗条件下，0.0%和0.5%乙醇作用的白藜芦醇处理组斑马鱼幼鱼游动距离显著减少。在对光线变化的应激反应中，0.5%乙醇作用下的白藜芦醇处理组光照期与黑暗期的游动距离比值显著增加；2.0%乙醇作用下白藜芦醇非处理组的光照期与黑暗期的游动距离比值＞1。结论 在斑马鱼幼鱼胚胎发育早期补充白藜芦醇对急性乙醇暴露所导致的自发游动行为异常有一定的改变作用。
［关键词］白藜芦醇；乙醇；自发运动；应激反应；行为
乙醇是一种水溶性以及脂溶性都非常好的极性小分子，对包括血-脑脊液屏障在内的各种生物膜都具有很强的穿透力，对神经系统的功能有显著影响。动物研究实验表明，乙醇对机体的运动能力、感觉能力乃至包括学习和记忆在内的高级认知功能都有损伤作用［1-4］。
斑马鱼是一种在发育生物学以及遗传学研究中被广泛应用的模式生物，近年来在神经药理学研究中的应用也逐渐增多。急性乙醇处理对斑马鱼的神经系统功能以及相关的行为学指标也有显著的影响［5-7］。
白藜芦醇是一种主要来源于花生、葡萄、蓝莓、虎杖等植物的天然多酚类化合物，有明显的生物活性，具有保护心血管系统、延缓衰老以及抗癌等功效，同时对于乙醇导致的肝脏以及神经系统损伤具有一定的缓解作用［8-10］。
本研究以新兴模式生物斑马鱼作为研究对象，探讨白藜芦醇处理对斑马鱼幼鱼在急性乙醇作用下自发运动、受激运动的影响。
1 材料和方法
1.1 动物
野生型AB型斑马鱼来源于复旦大学附属儿科医院转化中心，按照Westerfield所著的书［11］中的方法进行养殖和繁殖，室温和水温均为（28.5±0.5）℃，每日14 h光照，10 h黑暗循环（亮灯时间：8∶00，暗灯时间：22：00）。
1.2 试剂
乙醇为优级纯，国药集团化学试剂；白藜芦醇购自Vetec公司；链霉蛋白酶购自罗氏公司。
1.3 药物制备
1.3.1 链霉蛋白酶制备 取1 g链霉蛋白酶，用22.2ml的灭菌水溶解于50 ml离心管，密封试管，置于37℃水浴45min，轻柔震荡，制得浓度为45mg/m l的链霉蛋白酶，分装置于超低温冰箱保存备用。
1.3.2 乙醇溶液制备 分别量取乙醇0.2、0.4、0.8 m l，均使用系统水定容至 20 ml，制得浓度 （v/v%）为1.0%、2.0%、4.0%的乙醇溶液。
1.3.3 白藜芦醇溶液制备 电子天平称取白藜芦醇粉末0.030 g，使用系统水定容至1 L，制得浓度为0.03 g/L的白藜芦醇溶液。
1.4 仪器
电子天平：德国Sartorius公司；隔水式恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司；体视显微镜：德国Zeiss公司；斑马鱼行为学分析系统：法国ViewPoint公司；细胞培养TC24孔板（每孔半径r=8mm）：上海吉泰远成生物科技有限公司。
1.5 白藜芦醇预处理
取自然繁殖的0 dPF鱼卵若干颗，用链霉蛋白酶进行脱膜处理。取成功脱模且状态良好的鱼卵300颗并均分为两组，即白藜芦醇处理组和白藜芦醇非处理组。白藜芦醇处理组鱼卵使用0.03 g/L的白藜芦醇溶液从0 dPF养殖到4 dPF，再将0.03 g/L的白藜芦醇溶液换成系统水，养殖至5 dPF。白藜芦醇非处理组鱼卵使用系统水从0 dPF养殖到5 dPF。
1.6 行为学检测
将幼鱼转移至24孔板中，每孔1条幼鱼。向孔中加入1 ml不同浓度的乙醇溶液 （0.0%、0.5%、1.0%、2.0%）。将24孔板放入行为学分析系统箱体中。
1.7 开放旷场实验
斑马鱼幼鱼可以在每个孔中自由游动，由箱体内摄像机记录每个孔中斑马鱼幼鱼的游动轨迹。实验周期设置为40 min，分别是1～25 min处于光照适应期（正常环境）、26～30min处于光照测试期（正常环境）、31～35min处于黑暗期、36～40 min光照恢复（正常环境）。光照期：光照强度为100 Lux；黑暗期：光照强度为0 Lux。白藜芦醇处理组和白藜芦醇非处理组各测试3组，所有实验均在9：00～16：00完成。实验过程中，实验室周围保持安静，行为学检测的室温和水温均为（28.5±0.5）℃。
1.8 统计学处理
采用Viewpoint软件分析开放旷场实验的视频，导出游动距离、平均游动速度、游动时间等运动参数，30 s/次，并输出相关数据。主要分析第26～30分钟光照w行分析，数据比较采用双因素方差分析和Sidak分析，统计学检验水平设为0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 早期白藜芦醇处理对急性乙醇作用下斑马鱼幼鱼自发运动的影响
2.1.1 光照期 双因素方差分析显示，F乙醇=45.96，P乙醇＜0.01，F白藜芦醇=5.881，P白藜芦醇=0.0159。1.0%乙醇作用下白藜芦醇处理组和非处理组的斑马鱼幼鱼游动距离显著增加（P=0.0001、0.0034）。2.0%乙醇作用下白藜芦醇处理组和非处理组的斑马鱼幼鱼游动距离显著增加（P均＜0.01）（图1）。
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图1 5 dPF斑马鱼幼鱼在第一个光照期的总游动距离
2.1 .2黑暗期 双因素方差分析显示，F乙醇=21.14，P乙醇＜0.001，F白藜芦醇=10.85，P白藜芦醇=0.0011。0.5%乙醇作用下白藜芦醇处理组和非处理组的斑马鱼幼鱼游动距离显著增加（P=0.0091、0.0017）。1.0%P均＜0.01作用下白藜芦醇处理组和非处理组的斑马鱼幼鱼游动距离显著增加（P均＜0.01）。2.0%乙醇作用下白藜芦醇处理组的斑马鱼幼鱼游动距离显著增加（P=0.0153）。在相同乙醇浓度的情况下，0.0%和0.5%乙醇作用的白藜芦醇处理组斑马鱼幼鱼游动距离显著减少 （P= 0.0445、0.0100）（图2）。
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图2 5 dPF斑马鱼幼鱼在第一个黑暗期的总游动距离
2.2 早期白藜芦醇处理对急性乙醇作用下斑马鱼幼鱼对光照变化应激的影响
在2.0%乙醇作用下，白藜芦醇处理组和非处理组的光照游动距离与黑暗游动距离比值均显著增加（P均＜0.01）。在相同乙醇浓度的情况下，0.5%乙醇作用的白藜芦醇处理组的光照游动距离与黑暗游动距离比值显著增加（P=0.0063）（图3）。
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图3 5 dPF斑马鱼幼鱼对光照变化的运动应激反应
3 讨论
Karlsson等［12］给予小鼠不同浓度的乙醇，通过行为学测定发现低浓度乙醇能促进小鼠的自发活动水平，高浓度乙醇则出现自发活动水平被抑制的现象，这与成年斑马鱼对乙醇的反应基本一致，即在较低浓度乙醇的急性处理下表现出自发运动的增强，随着乙醇浓度的逐渐增高表现出运动的抑制，同时失去了对环境中刺激因素的反应［5］。本研究结果显示，在光照环境中给予斑马鱼幼鱼乙醇刺激，其自发活动水平随着乙醇浓度的增高而增加，这一现象与本研究的实验对象有关。5 dPF的斑马鱼幼鱼已经可以出现神经系统反应［6］，但与成鱼相比较，神经系统并未发育完全，对乙醇浓度的敏感性较低［7］，所以会产生2.0%乙醇作用的斑马鱼幼鱼在光照环境下自发运动水平上升的现象。
Emran等［13］的研究显示，在斑马鱼幼鱼发育到4 pPF时，野生型斑马鱼幼鱼对光线的刺激已经有相应的反应，即无论是光线突然从明亮变黑暗还是光线突然从黑暗变明亮，斑马鱼幼鱼都会出现惊吓反应，因此，当光线由明转暗时，斑马鱼幼鱼会出现游动的增加，这与光线变化所导致的应激作用相关。由于斑马鱼在黑暗中游动多，在光亮中游动少，因此光亮中游动距离与黑暗中游动距离的比值一般＜1，但本研究中，在2.0%乙醇作用下白藜芦醇非处理组比值＞1，提示在高浓度乙醇作用下，斑马鱼幼鱼的应激反应已基本消失。
Liu等［14］的研究发现，白藜芦醇干预可以通过其良好的抗氧化作用缓解小鼠慢性温和应激导致的抑郁症状，从而提高小鼠的自发活动水平。本研究中，在中低浓度乙醇的作用下，白藜芦醇处理组的游动距离比值均高于非处理组，说明白藜芦醇预处理可以降低斑马鱼幼鱼因乙醇诱导的应激反应增加。Hu等［15］的研究显示，白藜芦醇可以缓解脑内因可卡因戒断导致的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）上升；而在高浓度乙醇作用下，白藜芦醇处理组对应激反应消失的作用并不明显，这可能与预处理的白藜芦醇浓度有关。斑马鱼幼鱼的给药方式主要通过皮肤吸收，因此斑马鱼生活的水环境是唯一的给药介质，而白藜芦醇作为天然单体化合物，其在水中溶解度较低，仅为0.03 g/L。本研究选择该浓度为干预浓度，已发现其对乙醇造成的行为异常有一定的缓解作用，在进一步的研究中可尝试提高白藜芦醇的给药浓度，从而进一步探索白藜芦醇对神经损伤的具体缓解途径。
本研究中，在相同浓度乙醇的情况下，白藜芦醇处理组的斑马鱼幼鱼游动距离均多于非白藜芦醇处理组，但差异无统计学意义。Pal等［16］在白藜芦醇对氟化物诱导的基因损伤的作用研究中发现，白藜芦醇干预后脑内多巴胺含量显著增加，这说明白藜芦醇可能会通过增加多巴胺含量来增加斑马鱼幼鱼的自发游动水平。在柳富平等［17］对多巴胺和运动能力的研究中也验证了多巴胺含量增加可以提高运动能力这一观点。
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Influence of Resveratrol supp lement on behavior of zebrafish larvae to acute ethanol exposure
CHEN Hao-jun1LIN Jia2LIQiang2GUO Ning1▲
1.Center for Chinese Medical Therapy and Systems Biology，ShanghaiUniversity of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China；2.Translational Medical Center for Child Development and Disease-Shanghai Key Laboratory of Birth Defect of Institute of Pediatrics，Children′s Hospital，Fudan University，Shanghai 201102，China
1.Center for Chinese Medical Therapy and Systems Biology，ShanghaiUniversity of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China；2.Translational Medical Center for Child Development and Disease-Shanghai Key Laboratory of Birth Defect of Institute of Pediatrics，Children′s Hospital，Fudan University，Shanghai 201102，China
［Abstract］Objective To explore the influence of Resveratrol supplement on behavior of zebrafish larvae to acute ethanol exposure induced by different concentrations of ethanol under varying light conditions.Methods 300Wild-type AB strain zebrafish larvae（0 day post fertilization，0 dPF）without eggmembrane were randomly divided into two groups，and were treated with system water or resveratrol for 4 days，respectively.Each group was divided into 4 teams （36 per team）at 5 dpf，and acutely exposed under alcohol（0.0%，0.5%，1.0%，2.0%）.Distancemoved perminute was recorded under alternating 1ight-dark challenges，and the data was analyzed by two-factors analysis of variance.Results Acute exposure to 0.0%and 0.5%alcohol，the locomotor activity was decreased in Resveratrol supplement-treated zebrafish larvae in darkness.In the startle response to light changes，the swimming distance ratio of Resveratrol supplement under 0.5%alcohol exposured was significantly increased.The swimming distance ratio was showed over 1 in 2.0%alcohol treated groups without Resveratrol supplement.Conclusion Resveratrol supplement in early development of zebrafish larvae can exert significant influences on the behavior changes induced by acute ethanol exposure.
［Key words］Resveratrol；Alcohol；Spontaneousmovement；Startle response；Behavior
［中图分类号］R-332［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）08（b）-0015-04
（收稿日期：2016-04-25本文编辑：祁海文）
［基金项目］上海市教委科研创新项目（2012Z10268036）
［作者简介］陈昊珺（1991-），女，硕士，研究方向：中药治病的细胞与分子生物学基础
▲通讯作者：郭宁（1975-），男，博士，副研究员，硕士生导师，研究方向：疾病动物模型以及相关药理学研究