李　伟1　王战伟1　伍　晓2　于　斐1　张文涛1　江长青1
1.北京大学深圳医院运动医学和康复科，深圳　518036；2.北京大学深圳医院口腔科，深圳　518036

［摘要］目的 研究载淫羊藿素多孔聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）/磷酸三钙（TCP）材料联合微骨折术修复兔膝关节软骨缺损中骨与软骨结合的特性。方法24只兔子制造膝关节软骨缺损动物模型，随机分成空白组、对照组、实验组，每组8只，在软骨缺损处进行微骨折处理，分别不植入材料、植入PLGA/TCP材料和植入携载淫羊藿素的PLGA/TCP材料，6个月后进行CT评估及大体观察。结果CT显示实验组膝关节材料构建骨形态结构良好，对照组骨形态结构稍差，空白组良好骨支架结构丧失；大体观察显示实验组修复生软骨组织色泽接近正常，对照组软骨色泽稍灰暗，空白组示无软骨修复，大体评分结果显示实验组优于对照组及空白组（P＜0.05），对照组优于空白组（P＜0.05）。结论携载淫羊藿素的PLGA/TCP材料修复兔膝关节软骨缺损其支架结构与骨整合良好，软骨大体观察效果良好，为进一步探索其修复效果提供初步依据。

［关键词］PLGA/TCP材料；淫羊藿素；软骨缺损；初步观察

［Abstract］Objective To explore the characteristics of the PLGA/TCP scaffolds incorporating icariin in repairing the defect of knee cartilage of the rabbits.Methods The model of cartilage defect was created on the patellar groove.They were drilled by micro-fracture and divided into blank group，control group and experimental group，which received no scaffold，PLGA/TCP scaffolds and the the PLGA/TCP scaffolds incorporating icariin.They were sacrificed after 6 months. CT was used to explored the bone scaffold/three-dimensional structure and the gross observation was used to evaluated the articular cartilage.Results The CT scan showed they had whole and complete structure of knee in the experimental group and worse structure in the control group，the blank group had lose the whole structure.The gross observation showed the experimental group kept fresh color，and grey in the control group，the defect was kept in the blank group. The experimental group was better than that in control group and blank group（P＜0.05），and control group was better than blank group（P＜0.05）.Conclusion The PLGA/TCP scaffolds incorporating icariin can keep good structure in repairing the defect of knee cartilage.The gross observation of the articular cartilage in the experimental group is best.It provides primary basis for exporing the repair effect father.

［Key words］PLGA/TCP scaffold；Icariin；Defect of cartilage；Primary observation

创伤、肿瘤、炎症等引起的关节软骨缺损在临床实践中常见，软骨自身修复能力有限，直径＞4 mm时一般不能自行修复。虽然可采用异体软骨细胞修复、骨膜修复等多种方式，但大多近期效果理想，远期效果不确切甚至恶化。其重要原因是不能形成结构良好的有功能性软骨组织，如果只形成带有基质的软骨组织，而不能与软骨下骨、骨组织形成良好的结合，便不能承受相应力学刺激。许多学者都通过不同的方法构建组织工程骨软骨复合体来修复骨软骨联合损伤［1］，结果显示骨软骨复合体无论是功能学评分，还是GAG含量都要优于单纯的软骨修复［2］。

近几年随着组织工程技术的快速发展，支架、生长因子和种子细胞都有迅猛进步，本研究利用中药淫羊藿素（Icariin）作为细胞因子并于聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）/磷酸三钙（tricalcium phosphate，TCP）材料，使之在植入后能够形成新的软骨组织，从而达到软骨与软骨下骨、骨组织良好的结合。本研究还通过功能锻炼，使软骨构建良好力学功能，进行整体的修复与重建，初步观察相应材料对骨与软骨整合的效果，为进一步治疗软骨缺损提供依据。

1.1　实验动物与材料

选择雄性新西兰兔，6个月龄，体重2.0～2.5 kg，由西安市迪乐普生物资源开发有限公司提供［生产许可证：SYXK（粤）2010-0106］，遗传背景明确。饲养条件：保持室温（23±2）℃，相对湿度60%～65%，分笼饲养，喂标准颗粒饲料，自由饮水。PLGA/TCP材料由深圳-香港肌肉骨骼关节健康科学创新中心合作平台拥有具有自主知识产权的、自行设计与制造的生物材料快速成形机（如Tiss Form、Med Form和生物材料快速成形实验平台）在-10～-20℃低温下PLGA能够复合Icariin分子，其中Icariin的含量为1×10-5mol/L［3］，然后在冻干机中抽干，制备有一定的机械强度、利于血管向内生长的、促进成骨细胞生长的骨修复材料，相对于目前缺乏成形设计的常用的磷酸钙基材料，这一技术更加符合组织工程组织再生的需要，此材料在紫外线下进行消毒。

1.2　动物模型制备分组及软骨修复

利用戊巴比妥钠对24只新西兰兔进行静脉麻醉，常规消毒之后，于无菌条件下任选动物左侧膝关节做切口，暴露股骨内外髁关节面后，用手摇钻在左膝关节股骨髁间非负重区中央钻孔，直径5 mm，深约1 mm，达软骨全层，按体重随机分为空白组、对照组及实验组，每组8只。造模后各组进行微骨折治疗，利用4.5 mm的克氏针构建关节软骨缺损模型，深度约4 mm，深达软骨下骨。空白组不植入材料让其自行修复；对照组于动物软骨缺损处植入空白的PLGA/TCP材料，常规缝合切口；实验组于动物软骨缺损处植入携载Icariin的PLGA/TCP材料，并进行妥善嵌压固定，用庆大霉素2×104U冲洗关节腔后关闭切口，术后抗生素使用3 d，让其自由活动。

1.3　动物处死、取材及大体观察

正常饲喂6个月后采用过量麻醉的方法处死动物，处死后打开双侧膝关节囊，取膝关节股骨髁及部分滑车部位的软骨进行大体观察，观察膝关节有无关节积液和滑膜肿胀等滑膜炎表现，于解剖显微镜下观察股骨内髁关节面的病理改变，并进行大体标本评分。按以下原则评分。0分：关节面光整，色泽如常；1分：关节面粗糙，有小的裂隙且色泽灰暗；2分：关节面糜烂，软骨缺损深达软骨表中层；3分：关节面溃疡形成，缺损深达软骨深层；4分：软骨剥脱，软骨下骨质暴露［4］。

将处死新西兰兔的膝关节软骨标本在CT下进行扫描，CT值选择为SPOV 32.0 cm，120 KV，100 mA，TI0.5，观察其内部结构。

1.4　统计学处理

采用统计软件SPSS 19.0对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，等级资料采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1　CT评估

含淫羊藿素的PLGA/TCP材料能形成网格状或圆柱状三维结构，均匀，裁成直径4.5 mm，长4 mm大小，在这个三维结构里，构建一个边长为0.5 mm大小的孔隙，形成一个立体样的框架。空白组软骨明显缺损，内部的支架结构丧失，与软骨缺损面相通 （图1A）；对照组PLGA材料软骨表面已经修复尚可，材料已经降解，但其内部的结构却显得疏松，难以起到良好的支架结构（图1B）；实验组显示此材料与兔膝关节整合良好，6个月后软骨表面已经完全融合，CT图显示其内部结构清楚，可见材料已经降解，有明显的格网状支架结构，并与软骨表面相通（图1C）。

 

图1　各组的CT图

2.2　大体观察及评分

本实验显示手术当中能很好地形成一个边缘光滑的圆形微骨折（图2A），同时又能很好地将材料植入软骨缺损处（图2B），表面可见从小孔里渗出骨髓间质干细胞，可很好地覆盖在材料的表面（图2C）。空白组大体标本软骨修复关节面稍粗糙，色泽稍灰暗为主（图2D）；对照组大体标本软骨修复关节面稍粗糙，色泽稍灰暗为主（图2E）；实验组大体标本软骨修复关节面光滑，色泽正常，光泽度好（图2F）。大体评分结果显示实验组优于对照组及空白组（P＜0.05），对照组优于空白组（P＜0.05）（表1）。

 

图2　手术前后的材料及修复效果大体观察

A：携载Icariin的PLGA材料的大体观察；B：构建软骨缺损的模型；C：在软骨缺损中植入携载Icariin的PLGA材料；D：空白组修复软骨缺损的大体观察；E：对照组修复软骨缺损的大体观察；F：实验组修复软骨缺损的大体观察

表1　空白组、对照组、实验组软骨大体评分下的动物数量分布（只）

近年来随着组织工程学技术的发展，关节软骨缺损的修复取得了一定的进展，但迄今为止，无论是工程软骨的种子细胞、支架材料、培养环境等，均还没有任何一种材料被认为最理想，寻求一种功能性符合组织需要的组织工程化关节软骨是未来研究的重点［5］。

在软骨组织工程常用的支架材料选择中，按其来源可分为人工合成和天然材料两大类，其中PLGA是乳酸和乙醇酸聚合而成，其结构和亲、疏水性可以通过两者的不同比例进行调节，进而决定支架材料在体内的机械性能和降解速率［6］，其中PLGA降解过程中产生的酸性产物可能对细胞有毒性作用，在材料中引入碱性的TCP，可部分中和PLGA降解产物的酸性，改善材料周围环境pH值［7］，有助于消除无菌性炎症，从而有利于细胞的生长。同时，本实验显示PLGA/ TCP比单纯的PLGA稍硬，更适合材料的塑性、放置与固定［8］。在本实验结果显示，PLGA/TCP材料或携载Icariin的PLGA/TCP材料都能很好地构建一个支架结构并满足膝关节软骨的修复（图2E，F）及软骨下骨的构建（图1B，C）。

在生长调节因子方面，软骨组织工程的生长因子主要包括转化生长因子、骨形成蛋白、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等，这些生长因子是大分子蛋白质，作用时间较短，容易变性，提取较困难，费用较高。研究显示，天然植物活性分子淫羊藿素是一种小分子中药，广泛被应用于骨科临床，它不仅能促进成骨细胞的分化，还能增强其增殖能力，而且淫羊藿苷组分化与增殖能力优于rhBMP-2组，其机制可能是淫羊藿苷可以上调OPG基因表达，下调RANKL基因表达，从而减少骨吸收，促进骨形成［9-10］，同时它还能显著增加成骨细胞碱性磷酸酶的活性，提高骨修复能力［11］。淫羊藿素还有一个重要的功能，促进骨髓间质干细胞向软骨细胞定向分化，但不导致软骨细胞的肥大［12］。它还能提高软骨细胞体外细胞外基质的合成及相关基因的表达，是软骨组织工程中良好的生长因子［3］。实验显示其能使自体软骨细胞的蛋白多糖相关基因、Ⅱ型胶原纤维相关基因、SOX9等的表达从99.7%上调到248%，1～4周时使蛋白多糖、Ⅱ型胶原的合成增加4～5倍，并加速形成的软骨组织中的细胞水凝胶结构，它甚至可以提高成年兔模型骨软骨缺损的修复效率，提高新形成的软骨与软骨下骨的整合［13］。本实验显示，载淫羊藿素的PLGA/TCP材料相对PLGA/TCP材料无论在软骨修复大体观察及CT评价上都有良好的效果。

微骨折技术修复关节软骨缺损是骨科临床和实验研究的热点之一［14］，它是指在软骨全层剥脱的软骨下骨裸露部位打磨或钻孔，使软骨下血管破裂，人为造成全层损伤，从而在裸露的骨表面形成一层纤维凝块，为骨髓间充质干细胞的移行提供支架，在无过渡负荷的情况下，未分代的实质细胞游移至凝块内，并增殖分化成软骨细胞。与铲除裸露的骨面相比，小直径、多点钻孔可生成更为稳定的修复组织。微骨折技术可为软骨支架创造一个可以与骨髓相连的空间，从而为此支架从骨、软骨下骨到软骨层进行整体性构建提供活性细胞及生长因子。同时，现在的观点认为微骨折术结合生长因子或材料更能提高其修复软骨的能力［15］。本实验的CT扫描显示其修复后能完全修复微骨折形成的骨缺损，同时，PLGA材料能形成一个良好的通道，使骨髓内细胞可能通过材料的微孔隙进行软骨缺损表面。

中药是中国一个宝藏，里面有很多有效的药物，尤其在骨科的中药治疗中有很多有效的方法。本研究采用已经成熟加工的高纯度的传统中药淫羊藿素，它远比大分子蛋白质的生长因子要便宜的多，由于它是小分子，在制备材料中不易变性，更容易与PLGA/TCP材料进行结合并且逐渐释放对软骨缺损进行修复，是一种良好的、可缓释的细胞因子，为更有效地选择良好的修复关节软骨缺损的材料提供初步观察。

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Primary observation on PLGA/TCP scaffolds incorporating icariin in repairing the defect of knee cartilage accordance with the biological characteristics of the rabbits

LI Wei1WANG Zhan-wei1WU Xiao2YU Fei1ZHANG Wen-tao1JIANG Chang-qing1
1.Department of Sports Medicine and Rehabilitation，Shenzhen Hospital of Peking University，Shenzhen　518036，China；
2.Department of Stomatology，Shenzhen Hospital of Peking University，Shenzhen　518036，China

［中图分类号］R276.8

［文献标识码］A

［文章编号］1674-4721（2016）08（a）-0007-04

（收稿日期：2016-06-01本文编辑：卫　轲）

［基金项目］广东省深圳市医疗卫生类科研项目（201302057）