彭　强　吴传高　董柱清
福建医科大学附属闽东医院放疗科，福建福安　355000

［摘要］目的观察紫杉醇（PA）对人胃癌细胞株SGC7901放射敏感性的影响。方法 采用MTT法获得PA对SGC7901细胞的半数抑制浓度（IC50），并以20%的IC50剂量为增敏浓度；克隆形成实验检测单纯照射组与PA（增敏浓度）+照射组在0、2、4、6、8 Gy X线照射后的细胞存活率，并观察细胞周期的改变及细胞形态的变化。结果 PA对SGC7901细胞的IC50为16.11 μg/ml，随着照射剂量的逐渐增加，单纯照射组和PA+照射组细胞存活率呈下降趋势，从4 Gy开始，PA+照射组细胞的存活率低于单纯照射组（P＜0.05）；PA+照射组的G2/M期细胞比例高于其他两组，S期细胞比例低于其他两组（P＜0.05）。结论 PA对胃癌细胞株SGC7901具有放射增敏作用，其机制可能与诱导细胞凋亡及G2/M期阻滞有关。

［关键词］紫杉醇；人胃癌细胞株；放射增敏

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在中国死亡率居第3位［1-2］。目前胃癌的手术治疗、化学治疗和放射治疗取得了一定的进展，但由于胃癌的发病率高、转移率高且发现时多处于晚期，严重影响患者的生命质量。胃癌的放射治疗目前在其治疗中占重要地位。肿瘤细胞对放射线产生耐受性是影响肿瘤放疗效果的主要原因［3-5］。中药紫杉醇（paclitaxel，PA）能促进胞质内微管蛋白聚集，抑制其解聚，从而阻止细胞的有丝分裂，是临床常用的化疗增敏剂。本实验将PA作用于，探讨其对人胃癌细胞SGC7901放射敏感性的影响及可能存在的机制。

1.1　试剂和仪器

RPMI 1640、胰酶、96/6孔培养板购自Cellgro公司；CO2细胞培养箱、酶标仪购自Sanyo公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）购自Sigma公司。

1.2　细胞培养

人胃癌细胞株SGC7901（上海研成生物科技有限公司），细胞在RPMI 1640培养基，于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。2～3 d换液1次，细胞贴壁生长良好。

1.3　方法

1.3.1　照射方法　使用西门子PRIMUS-M型直线加速器进行照射。培养板下放置1 cm标准等效填充物（有机玻璃板），采用源轴距照射（等中心照射），剂量率2 Gy/min，照射面积10 cm×10 cm，源靶距100 cm［6］。

1.3.2　MTT法 采用MTT法获得PA对SGC7901细胞的半数抑制浓度（IC50）。按每孔5×103个/ml细胞均匀接种于96孔培养板，细胞贴壁后，更换不同浓度PA（5、10、20、40、80 μg/ml）分别加入各孔内，同时设空白组作对照，仅加入等量的培养液，不接种细胞。培养24 h后，弃去培养液，每孔加入MTT溶液10 μl，4 h后终止培养，离心后弃上清，加入DMSO溶解沉淀，490 nm波长测量吸光值（A），计算细胞抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（空白组A值-加药组A值）/空白组A值×100%。实验重复3次，取平均值得出IC50［7-8］。

1.3.3　克隆形成实验　取SGC7901细胞，消化接种成单细胞悬液，接种合适数量的细胞于6孔板中。实验分为单纯照射组和PA+照射组，两组都给予0、2、4、6 和8 Gy的X线照射，设置3个复孔。结晶紫染色，计算＞50个细胞的克隆数。

1.3.4　细胞周期检测 SGC7901细胞接种于6孔板中，浓度为1×106个/ml，培养24 h，分为空白对照组、单纯照射组、PA+照射组，以1000 r/min离心去除固定液，调整细胞加入碘化丙啶（PI）染液［9-10］，上机检测并分析细胞周期分布。

1.3.5　细胞光镜形态学观察　设空白对照组、单纯照射组、PA+照射组，配制0.15%的胰蛋白酶消化细胞，制成5×104个/ml单细胞悬液接种于24孔培养板中［11］，置于培养箱内培养48 h后，PBS洗涤，室温干燥后树胶封片，光镜下观察、拍照。

1.4　统计学处理

采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1　PA对胃癌SGC7901细胞IC50的统计

PA对胃癌SGC7901细胞的IC50为16.11 μg/ml，故选择IC50的20%即接近无毒药物浓度为3.21 μg/ml，用于克隆形成实验，作为放射增敏浓度。

2.2　PA对胃癌SGC7901细胞放射敏感性的影响

随着照射剂量的逐渐增加，单纯照射组和PA+照射组细胞存活率呈下降趋势，从4 Gy开始，PA+照射组细胞的存活率低于单纯照射组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1　不同照射剂量下胃癌SGC7901细胞的存活率（%，）

 

与单纯照射组比较，#P＜0.05

2.3　PA对胃癌SGC7901细胞周期分布的影响

与空白对照组比较，单纯照射组、PA+照射组的G2/M期细胞比例上升，但S期细胞比例下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。G0/G1期略有升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2　三组SGC7901细胞细胞周期比例分布的比较

 

与单纯照射组比较，#P＜0.05

2.4　光镜观察下的细胞形态学结果

光镜下观察SGC7901细胞排列分散，为多角形，SGC7901细胞界限清楚，细胞核圆形，体积大。PA+照射组细胞界限不清，细胞变圆，核仁着色浅，胞质内可见大量颗粒（图1）。

 

图1　SGC7901细胞形态学光镜下观察结果（×200）

恶性肿瘤对人类健康有严重威胁，放射治疗在肿瘤的治疗中具有重要作用。因为肿瘤本身存在的敏感性和乏氧程度等的不同，所以肿瘤对放射治疗敏感性有差异［12-13］。胃癌患者大多数对放射治疗的耐受性较差，因此使用良好的放射增敏剂是提高胃癌放疗效果的有效方法［14-15］。

PA抗癌机制主要是结合于细胞骨架的微管蛋白，促进微管蛋白的聚集，阻滞其解聚成亚单位，抑制有丝分裂的进行，进而诱导细胞凋亡［16-18］。实验证明PA具有放射增敏作用，可能是中止对放疗敏感的G2和M期［19］。

本研究中克隆形成实验结果显示，随着X射线照射剂量的增加，胃癌细胞的集落形成下降，同等剂量下，PA+照射组与单纯照射组比较，集落形成数量下降。自4 Gy照射剂量开始，单纯照射组和PA+照射组细胞的存活率比较差异显著，提示PA具有放射增敏作用。

放射生物学研究指出在细胞周期的不同时期放射的敏感性也不同，放疗最敏感为M期和G2期细胞，其次是G0/G1期，可通过使进入S期的细胞减少和造成G2/M期阻滞进而改变细胞周期，杀伤肿瘤细胞。在本研究中，PA+照射组G2/M期比例升高，S期比例下降，与单纯照射组比较，差异显著，提示PA对于胃癌细胞的增敏影响可能通过增加对放射线敏感的G2/ M期分布比例来实现，与相关文献报道［20］相吻合。

综上所述，PA对胃癌SGC7901细胞具有放射增敏作用，其机制可能是G2/M期阻滞。本研究为PA的综合治疗胃癌提供了一定的理论依据。

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Analysis of radiosensitivity of paclitaxel on human gastric cancer cell

PENG Qiang　WU Chuan-gao　DONG Zhu-qing
Department of Radiotherapy，Mindong Hospital Affiliated to Fujian Medical University，Fujian Province，Fuan　355000，China

［Abstract］Objective To observe the effect of paclitaxel（PA）on the radiosensitivity of human gastric cancer cell line SGC7901.Methods MTT assay was employed to obtain the 50%inhibition concentration（IC50）of PA on SGC7901 cells. 20%of the IC50dose was treated as sensitizing concentration.The clonogenic assay was used to analyze the cell viability of radiation group and PA（sensitizer concentration）plus radiation group with X-ray of 0，2，4，6 and 8 Gy.The changes of cell cycle and cell morphology changes were observed.Results The IC50of PA on SGC7901 cells was 16.11 μg/ml. The cell viability got decreased with increasing radiation dose in radiation group and PA plus radiation group.The cell viabilities of PA plus radiation groupwere lower than those of radiation group at the dose of 4，6 and 8 Gy.There was higher percentage in the G2/M phase，and lower percentage in the S phase in PA plus radiation group versus the other two groups（P＜0.05）.Conclusion PA can enhance the radiosensitivity of SGC7901 cells.The mechanism is connected with that it can induce cell apoptosis and G2/M phase retardation.
［Key words］Paclitaxel；Human gastric cancer cell line；Radiosensitization

［中图分类号］R739.63

［文献标识码］A

［文章编号］1674-4721（2016）08（a）-0004-03

（收稿日期：2016-05-05本文编辑：卫　轲）

［基金项目］福建省宁德市医药卫生类科技计划项目（20130124）