不同方法检测急性呼吸道感染患儿咽拭子与鼻拭子标本诊断呼吸道合胞病毒感染的评价
秦笙1 刘文宽2 原铁3 李际强4 陈茶1▲ 陈德晖5
1.广东省中医院检验医学部，广州510006；2.广东省中医院急诊科，广州510006；3.广东省中医院综合三科，广州510006；4.广州医科大学附属第一医院广州呼吸疾病研究所呼吸疾病国家重点实验室，广州510120；5.广州医科大学附属第一医院儿科，广州510120
1.广东省中医院检验医学部，广州510006；2.广东省中医院急诊科，广州510006；3.广东省中医院综合三科，广州510006；4.广州医科大学附属第一医院广州呼吸疾病研究所呼吸疾病国家重点实验室，广州510120；5.广州医科大学附属第一医院儿科，广州510120
［摘 要］目的比较不同方法检测急性呼吸道感染患儿咽拭子与鼻拭子标本的检测结果。方法收集2011年3月～2012年2月本院临床诊断为急性呼吸道感染的315名患儿的咽拭子和鼻拭子标本，采用实时荧光定量qPCR法和传统病毒培养鉴定两种方法同时检测病毒核酸或抗原，比较其结果。结果病毒培养鉴定方法中的鼻拭子和咽拭子阳性率分别为12.1%、6.7%，鼻拭子阳性率高于咽拭子（P＜0.01）。qPCR检测中的鼻拭子阳性率分别为17.1%和6.9%，鼻拭子阳性率高于咽拭子（P＜0.01）。鼻拭子和咽拭子标本分别用两种检测方法进行比较，qPCR的阳性率均高于病毒培养鉴定方法（P＜0.01）。以咽拭子培养与鉴定呼吸道合胞病毒（RSV）结果为标准，鼻拭子培养与鉴定、鼻拭子qPCR检测、咽拭子qPCR检测的敏感性分别为57%、91%、24%；特异性分别为91%、88%、94%。结论鼻拭子标本检测RSV的敏感度高于相应的口咽拭子，且qPCR方法检测RSV的敏感度高于传统病毒培养鉴定法。
［关键词］呼吸道合胞病毒；实时荧光定量PCR病毒培养与鉴定；鼻咽拭子
呼吸道感染是儿童的常见疾病之一。在全球范围内，病毒感染是导致儿童呼吸道感染的主要原因，其中呼吸道合胞病毒（RSV）是引起儿童呼吸道感染的最常见的病毒病原体之一。有研究［1］证实，其是引起婴幼儿下呼吸道感染的最常见病毒。随着分子生物学技术的不断改进，PCR技术被逐渐广泛地应用于临床及科研等领域，该技术具有敏感度高、检测速度快、检测特异性强的特点。在应用PCR技术进行检测时，不同的呼吸道病毒病原体在检测过程中，标本不同可能会影响到检测阳性率的偏差［2］。本研究选取315名诊断为急性呼吸道感染患儿的咽拭子和鼻拭子标本各1份，采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术以及病毒培养与免疫荧光鉴定方法，对RSV进行检测，比较不同检测标本、不同检测方法对结果的影响，为进一步研究RSV提供实验室数据支持。
1 材料与方法
1.1 要试剂和仪器
MEM（Invitrogen公司）、胎牛血清（Invitrogen公司）；胰蛋白酶（Amresco公司）；青霉素、链霉素（华北制药）；RSV单克隆荧光抗体（美国Chemicon公司）；细胞培养瓶（Corning公司）。核酸提取试剂盒（qiagen viral RNAminiextraction kit，荷兰，Qiagen），实时荧光定量qPCR试剂盒（quantiTect R probe RT-PCR kit）。HEp-2细胞购自中科院上海细胞库。
1.2 胞准备
生长良好的MDCK细胞以1×105个/m l接种细胞管中，2m l/管，细胞管置4°倾斜试管架中，放36℃、5%CO2培养2 d即可长满管壁。
1.3 本采集
2011年3月～2012年2月采集广东省中医院急诊及广州医科大学第一附属医院儿科315份符合呼吸道感染诊断患儿的咽拭子及鼻拭子。
1.4 本采集及处理
1.4.1 拭子标本采集方法采集前需摆放好患儿体位，以免在采集咽拭子时因咽部刺激而大量呕吐，污染标本。使用压舌板压住患儿舌头，用无菌棉签刮擦咽侧壁及咽后壁，将采集后的拭子置于病毒运送培养基中，以冰盒运送至实验室，放-80℃保存。
1.4.2 拭子采集方法拭子以耳垂与鼻尖方向插入鼻孔3～6 cm，使拭子在鼻内停留15 s，然后轻轻旋转3次，放入病毒运送培养基中，以冰盒运送至实验室，放-80℃保存。
1.4.3 本准备标本使用时，室温复温，在振荡器上充分混匀拭子标本，将拭子于试管管壁反复挤压、挤干液体；液体经4℃、3000 r/min离心10 min，去除上清液，取沉淀物备用。
1.5 毒培养与免疫荧光鉴定方法
1.5.1 毒培养每个细胞培养管接种标本上清液0.2ml，作复管，以RSV Long株为阳性质控对照，同时设立细胞阴性对照。标本36℃吸附2 h后，弃去上清液，加入含4%胎牛血清的病毒培养液2 m l/孔，继续培养6～8 d。每天观察细胞病变（CPE），单层细胞出现局部大而形态不规则的细胞融合，形成多核巨细胞时则判断为CPE阳性。进一步作免疫荧光法进行鉴定；阴性标本盲传1～2代后以上述方法进行确认。
1.5.2 疫荧光法鉴定吸取细胞管的上清液仅留少数几滴，将细胞从管壁刮下，取细胞悬液15μl至多孔玻璃片待干备用，免疫荧光染色方法按照试剂说明书进行，正置荧光显微镜下观察，细胞内特异性苹果绿荧光视为阳性。
1.6 qPCR
1.6.1 RNA的提取采用荷兰qiagen公司生产的qiagen viral RNA mini extraction试剂盒从拭子标本中提取病毒RNA，按试剂盒操作说明书进行。
1.6.2 应体系与条件引物和探针序列见表1［3］。扩增的引物基因区段如下。扩增反应体系参见说明书；扩增条件：45℃10min，94℃10 min，94℃30 s，共45个循环；60℃1min。
表1 引物与探针序列
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1.6.3 测结果判断Ct值＜35（Ct是指反应管内荧光信号到达设定阚值时所经历的循环数）为内参照RNase P阳性，Ct值＜37为RSV阳性。若Ct值在37～40之间则是灰度区，需重复采样检测。
1.7 计学处理
采用SPSS 11.5统计学软件对数据进行处理，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 同标本使用不同方法检测结果
分别使用鼻拭子和咽拭子标本用病毒培养鉴定和qPCR两种方法进行检测，结果见表2。病毒培养鉴定方法中鼻拭子和咽拭子阳性率分别为12.1%（38/315）和6.7%（21/315），鼻拭子阳性率高于咽拭子（χ2= 43.1，P＜0.01）。qPCR检测中鼻拭子阳性率分别为17.1%（54/315）和6.9%（22/315），鼻拭子阳性率高于咽拭子（χ2=60.2，P＜0.01）。鼻拭子和咽拭子标本对病毒培养鉴定法和qPCR两种方法进行阳性率比较，差异有统计学意义（χ2=43.1、60.2，P＜0.01），qPCR阳性率高于病毒培养鉴定方法。
表2 315例患儿呼吸道不同类型标本采用不同方法检测RSV结果的比较（n）
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病毒培养与鉴定检测不同类型标本比较，χ2=43.1，aP＜0.01；qPCR检测不同类型标本比较，χ2=60.2，bP＜0.01；鼻拭子标本两种检测方法比较，χ2=88.4，cP＜0.01；咽拭子标本两种检测方法比较，χ2=9.8，dP＜0.01
2.2 同类型标本和不同检测方法的效率比较
以咽拭子培养与鉴定RSV结果为标准，比较鼻拭子培养与鉴定RSV，鼻拭子qPCR检测RSV核酸，咽拭子qPCR检测RSV核酸的效率，结果见表3。
表3 不同类型标本和不同检测方法的效率比较（%）
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3 讨论
RSV感染是儿童急性呼吸系统疾病常见的病因之一。有研究［4-6］显示，RSV病毒是我国儿童呼吸道感染病原体中最常见的呼吸道病毒种类。在＜2岁的婴儿中，约90%的人群有RSV病毒感染史［7］。经流行病学调查，全球每年约有3380万名5岁以下的儿童感染RSV，其中死亡病例达到6.6万～19.9万［8］，严重威胁婴幼儿的生命［9］。据报道，RSV病毒的基因型众多。上海市于2009～2012年共检出10种基因型，其中2009年11月～2010年2月每月均可检出4～5种基因型，并导致RSV的局部暴发流行［10］，因此，及时、准确地检测RSV病毒对于控制暴发流行以及保障婴幼儿生命安全至关重要。
在临床治疗中，快速准确的结果是诊断和治疗的有力支持，这点在病毒爆发时段内尤为重要。病毒分离培养一直是病毒检测的“金标准”，但此种方法需要熟练的技术和过长的检测时间，一直无法实现快速检测，同时要求较高级别的操作环境（如细胞培养间及生物安全实验室）和熟练的检验人员，所以一直以来在我国广大基层医院未得到推广。随着医学科技的不断发展，分子生物学技术逐渐被广泛地应用于呼吸道病毒感染快速检测和精确诊断［11］。在欧美地区，鼻拭子检测法在临床实践中被认为是诊断呼吸道病毒感染最好的方法［12］。不论鼻拭子还是咽拭子，配以实时荧光定量技术进行RSV-DNA序列检测，都是呼吸道病毒感染快速诊断的有效方法［13］。RSV病毒、流感病毒等在不同呼吸道标本中的阳性率比较结果显示，不同种类的病毒在不同的采集方法采集到的标本中存在差异［14-15］，提示针对不同种类的病毒需采用不同的采集标本方法。
本研究利用病毒培养法和qPCR法对315例急性呼吸道感染患儿的鼻、咽拭子双份标本进行RSV检测，结果发现鼻拭子标本阳性率高于咽拭子标本，qPCR阳性率高于培养与鉴定检测方法。与咽拭子病毒培养法结果比较，鼻拭子的qPCR的敏感性和特异性分别为91%、88%，提示该方法适用于上呼吸道感染患儿，且是一种稳定、可靠的RSV检测方法。
综上所述，在临床实践中对急性呼吸道感染患儿的病毒检测推荐使用鼻拭子标本，使用qPCR方法是实现病毒检测的快速方法，值得进一步在临床实验室应用、推广及探索。
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Evaluation of different methods in the diagnosis of respiratory syncytial virus infection in patients with acute respiratory tract infection by throat swab and nasal swab
QIN Sheng1LIUWen-kuan2YUAN Tie3LIJi-qiang4CHEN Cha1▲CHEN De-hui5
1.Department of Laboratory Medicine，Traditional Chinese Medical Hospital of Guangdong Province，Guangzhou 510006，China；2.Department of Emergency，Traditional Chinese Medical Hospital of Guangdong Province，Guangzhou 510006，China；3.The Third Integrative Department，Traditional Chinese Medical Hospital of Guangdong Province，Guangzhou 510006，China；4.State Key Laboratory of Respiratory Disease，Guangzhou Institute of Respiratory Diseases；the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510120，China；5.Department of Pediatrics，the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510120，China
1.Department of Laboratory Medicine，Traditional Chinese Medical Hospital of Guangdong Province，Guangzhou 510006，China；2.Department of Emergency，Traditional Chinese Medical Hospital of Guangdong Province，Guangzhou 510006，China；3.The Third Integrative Department，Traditional Chinese Medical Hospital of Guangdong Province，Guangzhou 510006，China；4.State Key Laboratory of Respiratory Disease，Guangzhou Institute of Respiratory Diseases；the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510120，China；5.Department of Pediatrics，the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510120，China
［Abstract］Objective To compare the detection result of throat swab and nasal swab samples from children with acute respiratory tract infection detected by differentmethods.M ethods A total of 315 children with respiratory infection were recruited from March 2011 to February 2012，both throat swabs and nasal swabs were collected.Viral nucleic acid or antigen was detected by both qPCR and virus culture method，the result was compared.Resu lts With virus culture method，the positive rate of nasal swabswas 12.1%，which was higher than 6.7%of throat swabs（P＜0.01）.However，with qPCR，the positive rate of nasal swab was 17.1%，which was higher than 6.9%of throat swabs（P＜0.01）.Moreover，for the nasal swabs and throatswabs，the positive rate of qPCR was higher than that of virus culture（P＜0.01）.Base on the outcome of respiratory syncytial virus（RSV）detected with virus culture in throat swabs，the sensitivities and specificities of nasal swabs by virus culture，nasal swabs by qPCR and throat swabs by qPCR was 57%，91%，4%and 91%，88%，94，respectively.Conclusion The detection of RSV with nasal swabs ismore sensitive than throat swabs，and qPCR is more sensitive than virus culture.
［Key words］Respiratory syncytial virus；qPCR；Virus culture；Throat and nasal swab
［中图分类号］R725.6［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）07（c）-0118-04
［基金项目］广东省中医药局建设中医药强省科研课题（2015126）
［作者简介］秦笙（1983-），男，医学硕士，主管技师，主要从事临床病毒学诊断研究
▲通讯作者：陈茶（1970-），男，教授，博士生导师，主要从事细菌耐药性研究
（收稿日期：2016-05-27 本文编辑：祁海文）