外源性硫化氢对大鼠静脉移植物内膜增生的影响
杨红伟　王祖辉　陈恒　朱国献　李涛　谭毅华
深圳市第二人民医院心血管外科，深圳518035
［摘　要］目的探讨外源性硫化氢对静脉移植物内膜增生的影响。方法建立大鼠颈外静脉移植模型，24只雄性大鼠随机分成对照组和实验组，每组12只，实验组给腹腔注射硫化氢的供体硫氢化钠（NaHS），对照组给予相同剂量的生理盐水，术后2、4周分别切除移植静脉，计算机图像分析系统测量和计算内膜、中膜厚度，用免疫组织化学方法检测静脉移植物平滑肌细胞增殖细胞核抗（PCNA）的表达，统计分析所有大鼠内膜厚度和内膜截面积、PCNA指数情况。结果两组静脉移植物在切取时均保持通畅，无血栓和闭塞，其中实验组和对照组静脉移植物的内膜和中膜的厚度在术后增加明显，而实验组内膜、中膜厚度与对照组比较，在术后2、4周增加较轻，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组静脉移植物在切取时PCNA阳性细胞主要分布于静脉移植物中膜近管腔侧与内膜，其中实验组和对照组PCNA指数在术后降低明显，而实验组内膜、中膜厚度与对照组比较，在术后2、4周降低较轻，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论外源性硫化氢可有效抑制主动脉平滑肌细胞的增殖和促进其凋亡，抑制静脉移植物内膜的增生，有利于预防静脉桥再狭窄的发生，值得临床进一步推广。
［关键词］硫化氢；静脉移植物；内膜增生
大隐静脉仍然是目前冠状动脉旁路移植术中最常用的移植血管，静脉移植物再狭窄是影响冠状动脉旁路移植术疗效的主要因素。静脉移植物平滑肌细胞（SMC）的过度增生、向内膜迁徙并分泌大量细胞外基质引起内膜增生，并在此基础上形成粥样硬化，是引起静脉移植物再狭窄的主要原因。研究发现硫化氢具有舒张血管平滑肌，对动脉SMC具有抑制增生和促进凋亡的作用，并可抑制血管粥样硬化，对损伤动脉的内膜增生及再狭窄有显著的抑制作用。本实验建立大鼠自体静脉移植模型，给予外源性硫化氢进行干预，观察其对静脉移植物内膜增生的影响，为预防静脉移植物再狭窄提供科学的临床依据。
1　材料与方法
1.1　验动物与分组
3个月龄雄性SD大鼠24只，由南方医科大学动物中心提供，按照完全随机的方法将动物分为两组，每组12只，所有实验组大鼠在造模结束时即给予腹腔注射硫化氢的供体硫氢化钠（NaHS）（购于Sigma公司），剂量为30μmol/kg（溶于生理盐水中，浓度10 mmol/L），以后每天注射一次，所有对照组大鼠术后腹腔注射相同剂量的生理盐水并常规喂养，两组大鼠分别于术后2、4周随机选取6只大鼠，即术后2周随机选取6只，剩余6只为术后4周。
1.2　物模型的建立
所有大鼠均采用10%水合氯醛以0.3 m l/100 g体重腹腔注射麻醉并固定，取右颈部胸锁乳突肌前切口，长约3 cm，手术显微镜下钝性分离颈前肌群，以“不接触技术”分离出颈外静脉，截取颈外静脉15mm，肝素盐水（5000 U/L）冲洗管腔，显露颈动脉鞘，游离右侧颈总动脉约2 cm并于腹腔注射肝素（25 U/100 g），完毕后以无损伤血管夹夹闭颈总动脉近心端和远心端，在两血管夹中间切除5 mm动脉，以9-0带针缝线间断缝合，将颈外静脉倒置吻合于颈总动脉上，然后松开血管夹，观察静脉移植物充盈并随动脉血流搏动，远端颈动脉无搏动或搏动微弱的大鼠视为静脉移植失败，则需选取新大鼠重新建立动物模型，待动物苏醒后送动物中心饲养。
1.3　本处理
分别于术后2、4周取颈静脉移植物标本，所有大鼠麻醉后由原切口找到静脉桥，观察静脉桥通畅后切取静脉桥作为标本，用生理盐水冲洗标本干净后固定于4%聚多甲醛溶液中以备光镜制片，光镜标本石蜡包埋，5μm连续切片，苏木精-伊红（HE）染色、弹力纤维染色（Weigert法）。
1.4　量内膜、中膜的厚度
切片行HE染色和弹力纤维染色后，在Axiotron研究型显微镜下观察切片，导入全自动图象分析系统（Image ProPlus 6.0），每张切片随机选择4个区域测量内膜、中膜厚度，所得结果取平均值。
1.5　殖细胞核抗原（PCNA）的检测
切片行PCNA（鼠抗，抗体稀释度1∶200，Dako公司）单克隆抗体染色。操作方法根据抗体使用说明书，采用微波即用型（Envision）二步法，二氨基联苯胺（DAB）显色（二抗为抗鼠的DAB二抗，迈新公司试剂盒），苏木精复染，其中阳性细胞表现为细胞核中有棕黄色颗粒，于400倍光学显微镜下计数单位视野阳性细胞数占总细胞数的百分比以进行结果判定，占比＞30%视为阳性，≤30%视为阴性。
1.6　计学处理
采用统计软件SPSS 16.0对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　组术后2、4周静脉移植物内膜厚度和中膜厚度的比较
两组静脉移植物在切取时均保持通畅，无血栓和闭塞，其中实验组和对照组静脉移植物的内膜和中膜的厚度在术后增加明显，而实验组内膜、中膜厚度与对照组比较，在术后2、4周增加较轻，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1、表2）。
表1　两组术后2、4周静脉移植物内膜厚度的比较（μm，±s）

表2　两组术后2、4周静脉移植物中膜厚度的比较（μm，±s）

2.2　组PCNA指数的比较
两组静脉移植物在切取时PCNA阳性细胞主要分布于静脉移植物中膜近管腔侧与内膜，其中实验组和对照组PCNA指数在术后降低明显，而实验组内膜、中膜厚度与对照组比较，在术后2、4周降低较轻，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。
表3　两组免疫组织化学测定PCNA指数的比较（±s）

3　讨论
大隐静脉是冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass grafting，CABG）中重要的血管移植物［1-2］。静脉移植物再狭窄是影响CABG疗效的主要因素。取材时的机械创伤、为克服痉挛的压力扩张、缝线的机械损伤、缺血再灌注、动脉系统的持续高压等造成了血管内皮损伤，继而引起中层SMC增殖，向内膜迁移并分泌大量细胞外基质，导致内膜增生，在此基础上形成粥样硬化，引起静脉桥堵塞或狭窄，严重影响术后近远期疗效［3-4］。
目前，预防静脉移植物再狭窄的方法较多，但缺乏行之有效的办法。硫化氢是继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后又一新的具有心血管调节功能的气体信号分子，具有广泛的心血管保护功能［5-6］。研究表明，在哺乳动物体内，心血管组织中内源性硫化氢主要通过胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionin-γ-lyase，CSE）催化产生，而硫化氢在体内有2种存在形式：1/3以气体硫化氢形式存在，2/3能以硫氢化钠（NaHS）形式存在，其中NaHS在体内可解离钠离子和硫氢根离子（HS-），后者与体内氢离子结合成硫化氢，硫化氢与NaHS形成一种动态平衡，所以外源性给予NaHS可提高体内硫化氢的水平［7-8］。
体外研究发现，硫化氢对主动脉平滑肌细胞具有抑制增殖和促进凋亡的作用，有学者研究证实通过外源性给予硫化氢可减轻球囊所致大鼠颈动损伤后新生内膜的形成［9-10］。另有学者发现，外源性给予NaHS可抑制肺动脉高压模型中肺血管结构的重构，其作用主要是通过抑制平滑肌细胞增殖和促进其凋亡实现的，同时静脉桥再狭窄、动脉损伤后再狭窄以及其他血管重构的共同机制是中层平滑肌细胞增殖和内膜增生，其发生机制有相似之处，笔者预测硫化氢可能对预防静脉桥再狭窄起一定的作用［11-13］。
本研究建立大鼠颈动脉自体颈静脉移植模型，实验组腹腔注射NaHS予以干预，结果显示两组静脉移植物的内膜和中膜的厚度在术后增加明显，而实验组内膜、中膜厚度与对照组比较，在术后2、4周增加较轻，两组PCNA指数在术降低明显，而实验组内膜、中膜厚度与对照组比较，在术后2、4周降低较轻，说明内膜增生程度明显低于对照组，PCNA是平滑肌细胞增殖的重要标志，提示硫化氢可能抑制了静脉移植物平滑肌细胞的增生，平滑肌细胞增生在静脉移植早期更明显，所以要尽早采取措施预防平滑肌细胞增生。本实验初步证实了硫化氢在预防静脉移植物内膜增生方面发挥一定的作用，其机制可能是硫化氢在体内可解离HS-，HS-与体内氢离子结合成硫化氢，使硫化氢与NaHS形成一种动态平衡，进而保护了内皮细胞，同时由于内皮细胞受到保护，继而降低机体内血管内皮的损伤，进而抑制损伤所致SMC细胞增殖，使其PCNA指数表现为下降，进而减轻了内膜的增生［14-16］。
综上所述，外源性硫化氢可有效抑制主动脉平滑肌细胞的增殖和促进其凋亡，抑制静脉移植物内膜的增生，有利于预防静脉桥再狭窄的发生，值得临床进一步推广。
［参考文献］
［1］Mark MP，Christopher KH，Matthew W，et a l.Hydrogen sulfide inhibits proliferation and release of IL-8 from human airway smooth muscle cells［J］.Am JRespir Cell Mol Biol，2011，45（4）：746-752.
［2］张远达，冀超玉，王静，等.川崎病患儿硫化氢与白细胞介素1β、白细胞介素6水平的变化及其相关性［J］.中华实用儿科临床杂志，2015，30（21）：1676-1677.
［3］于文，金红芳.气体信号分子硫化氢血管调节作用的研究进展［J］.转化医学杂志，2013，2（14）：227-231.
［4］周红，梁小，吴晓燕，等.不同剂量硫化氢抗大鼠动脉粥样硬化的研究［J］.中国现代医学杂志，2013，23（27）：1-5.
［5］陈斯瑶，金红芳，孙燕，等.二氧化硫对低氧性肺动脉高压大鼠内源性硫化氢体系的调节作用［J］.中华儿科杂志，2011，49（12）：890-894.
［6］郭鸿鸣，肖天宇，谢彦杰.气体信号分子硫化氢在植物中的生理功能及作用机制［J］.中国生物化学与分子生物学报，2016，32（5）：488-495.
［7］汪金丽，沈兵，范一菲，等.NaHS对慢性间歇性低氧大鼠胸主动脉血管张力的影响［J］.安徽医科大学学报，2016，51（3）：329-332.
［8］贾静，何江波，曾韦锟，等.外源性硫化氢对心肌肥大的保护作用［J］.国际心血管病杂志，2015，42（6）：403-406.
［9］乔伟丽，杨文学，刘磊，等.外源性硫化氢减轻D-半乳糖诱导的亚急性衰老大鼠血管老化［J］.生理学报，2014，66（3）：276-282.
［10］Richard SB，Shawn EB.Vascular complications of cystathionineβ-synthase deficiency：future directions for homocysteine-to-hydrogen sulfide research［J］.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2011，300（1）：H13-H26.
［11］强俊叶，翟瑶，张静，等.外源性硫化氢对足月妊娠子宫平滑肌收缩功能的影响［J］.中国医药导报，2016，13（5）：95-98.
［12］宋志强，张建鹏.硫化氢对血管平滑肌细胞的影响［J］.生物技术通讯，2015，26（6）：871-875.
［13］Huang W，Chen S，Li XL，et al.The role of endogenous hydrogen sulfide（H2S）in the rats with diabetic nephropathy（DN）［J］.JCapital Univ Med Sci，2015，36（3）：505-507.
［14］袁平，王丽丽，王岚，等.硫化氢供体对低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞小窝蛋白的影响［J］.中华老年多器官疾病杂志，2015，14（12）：923-928.
［15］全晓静，罗和生，陈炜，等.一氧化氮和硫化氢对大鼠结肠平滑肌钙钾电流影响的比较［J］.中华实验外科杂志，2015，32（12）：3053-3057.
［16］兰丽，吉散，季晖.硫化氢对抗脑缺血再灌注损伤的机制研究进展［J］.药学进展，2016，40（4）：293-298.
Effect of hydrogen sulfide on intimal hyperp lasia of vein grafts in the rat
YANG Hong-wei WANG Zu-hui CHEN Heng ZHU Guo-xian LITao TAN Yi-hua
Department of Cardiovascular Surgery，Shenzhen Second People′s Hospital，Shenzhen 518035，China
［Abstract］Objective To investigate the effect of hydrogen sulfide on intimal hyperplasia in the rat vein grafts.M ethods External carotid vein transplantation model of rats was established，24male rats were randomly divided into the control group and experimental group，each group of 12，the experimental group was given the administration of the hydrogen sulfide donor NaHS，control group was given the same dose of normal saline，2 weeks and 4 weeks after excision of transplanted vein respectively，computer image analysis system was used tomeasure intimal and medial thickness in the endometrium was calculated，mmunohistochemicalmethod was used to detect vein graft smoothmuscle cell proliferation nucleus（PCNA）expression，statistical analysis of all rats intimal thickness and intimal sectional area，the PCNA index was given.Results Two groups of VG were kept unobstructed，at the time of taking no thrombosis and occlusion，the experimental group and control group of vein grafts in endometrium and the thickness of themembrane after surgery were significantly increased，while the experimental group in the endometrium，compared with control group，intimal thickness 2 weeks and 4 weeks after surgery was increased lighter，with significant difference（P＜0.05）；the two groups of VG in the PCNA positive cellsmainly distributed in near the lumen side and innermembranes in VG PCNA index after surgery，in the experimental group and control group were reduced obviously，and compared with control group，the experimental group in the endometrium，intimal thickness，2 weeks and 4 weeks after surgery was reduced lighter，with significant difference（P＜0.05）.Conclusion Exogenous hydrogen sulfide can effectively restrain the aortic smooth muscle cell proliferation and promote its apoptosis，inhibition of vein graft intimal hyperplasia，it is advantageous to the prevention of the occurrence of restenosis bridge，it isworth clinical for further promotion.
［Key words］Hydrogen sulfide；Vein graft；Intimal hyperplasia
［中图分类号］R575.2
［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）07（c）-0008-03
［基金项目］广东省深圳市科技研发资金项目（JCYJ2013040 1110316744）
（收稿日期：2016-05-25　本文编辑：卫　轲）