RP-HPLC法同时测定胆石消胶囊中四种蒽醌类成分的含量
何清彦1 张智敏2▲ 刘灿黄3
1.湖南省娄底市食品药品监督管理局娄星分局，湖南娄底417000；2.湖南中医药大学药学院，长沙410208；3.湖南省娄底市食品药品检验检测所，湖南娄底417000
1.湖南省娄底市食品药品监督管理局娄星分局，湖南娄底417000；2.湖南中医药大学药学院，长沙410208；3.湖南省娄底市食品药品检验检测所，湖南娄底417000
［摘 要］目的建立以RP-HPLC法同时测定胆石消胶囊中大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量测定方法。方法采用Waters SunFire C18柱（250mm×4.6mm，5μm），以甲醇-0.1%磷酸（85∶15）为流动相，流速：1.0m l/min，柱温：28℃，检测波长：254 nm。结果大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚进样量分别在0.132 08～0.792 48μg、0.087 52～0.525 12μg、0.111 84～0.671 04μg、0.080 16～0.480 96μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，相关系数分别为0.9998、0.9996、0.9994、0.9997，平均加样回收率分别为99.32%、98.80%、99.05%、99.14%，RSD分别为0.76%（n=9）、1.31%（n=9）、1.41%（n=9）、0.94%（n=9）。结论本方法简便易行，专属性强，准确度高，重现性好，可作为胆石消胶囊质量控制方法。
［关键词］反向高效液相色谱法；胆石消胶囊；大黄酸；大黄素；大黄酚；大黄素甲醚
胆石消胶囊为医院制剂，处方中含有大黄、茵陈、金钱草、黄芩等中药材，具有清热利湿、利胆排石的功效，临床用于胆道结石、胆道感染以及胆囊炎等，疗效显著。大黄是本方中君药，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄的功效。大黄的主要化学成分为蒽醌类化合物，现代药理研究表明，大黄作用的物质基础也主要是蒽醌类化合物，大黄中的蒽醌类成分能够疏通毛细胆管，促进胆汁分泌，改善胆小管内胆汁淤积，增加胆红素排出；大黄还能促进胆囊收缩，松弛奥狄氏扩约肌，增加胆汁排出量。体外实验表明，大黄中含有的大黄酸、大黄素、芦荟大黄素对多种致病菌均有抑制作用。此外，大黄还有一定的抗炎作用［1］。本文参考《中国药典》2015年版一部及有关文献资料［2-13］，建立了同时测定胆石消胶囊中大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚四种蒽醌类化合物含量的RP-HPLC法，为提高胆石消胶囊的质量标准提供研究基础，为其他含大黄制剂中蒽醌类成分的含量测定提供参考。
1 材料与方法
1.1 要仪器
Waters2695高效液相色谱仪，2998 PDA检测器，Empower 3色谱工作站；CBL9960A超声波清洗器（上海科导超声仪有限公司）。
1.2 要试剂
对照品：大黄酸（批号：110757-201306）、大黄素（批号：110757-2013110）、大黄酚（批号：110796-20135）、大黄素甲醚（批号；110758-201310），均购自中国药品生物制品检定所；胆石消胶囊（批号为150214、150215、150216）；阴性样品系按胆石消胶囊处方工艺制备不含大黄的供试品；磷酸、甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。
1.3 验方法
1.3.1 谱条件
色谱柱：Waters SunFire C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸（85∶15）；流速：1.0 ml/ min；柱温：28℃；检测波长：254 nm；进样量：10μl。理论塔板数以大黄素峰计算应不低于4000。
1.3.2 液制备
1.3.2.1 照品溶液的制备精密称取大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚四种对照品分别为16.51、10.94、13.98、10.02mg，置50 ml量瓶中，加甲醇，超声处理10 min（功率200W，频率40 kHz）使之溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得每1毫升含大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚分别为0.3302、0.2188、0.2796、0.2004 mg的混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液1.00 ml，置50 m l量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得每1毫升含大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚分别为0.066 04、0.043 76、0.055 92、0.040 08 mg的混合对照品溶液。
1.3.2.2 试品溶液的制备取胆石消胶囊内容物粉末约4.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（10∶1）混合溶液25 ml，85℃加热回流1 h后放冷，转移至50 ml量瓶中，用少量甲醇洗涤容器，洗涤液并入50 m l量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即制得供试品溶液。
1.3.2.3 性对照溶液的制备按胆石消胶囊处方工艺，取除大黄以外的其他中药饮片，按“1.3.2.2”项下方法操作，制得不含大黄的阴性对照溶液。
1.3.3 法学考察
1.3.3.1 统适用性考察分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定分析。
1.3.3.2 性关系考察按“1.3.1”项下色谱条件，分别精密吸取混合对照品溶液2、4、6、8、10、12μl注入色谱仪，记录峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），质量数（μg）为横坐标（X），进行回归方程计算，考察线性关系。
1.3.3.3 复性考察取批号为150216的胆石消胶囊内容物，按“1.3.2.2”项下方法制备供试品溶液6份，分别进样，记录峰面积，计算大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量。
1.3.3.4 密度考察取混合对照品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件，重复进样6次，每次10μl，分别计算大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚色谱峰面积的RSD值。
1.3.3.5 定性考察取重复性考察中供试品溶液1份，分别于0、4、8、16、32 h进样测定，记录峰面积，分别计算大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚色谱峰面积的RSD值。
1.3.3.6 样回收率试验取已知含量的批号为150214的胆石消胶囊内容物粉末9份，每份2.0 g，精密称定，分别加入混合对照品储备液2、4、6 m l，按“2.2.2”项下制备方法制得供试品溶液，每个浓度6份，进样测定，记录峰面积。
2 结果
2.1 统适用性考察
由图1可知，理论塔板数按大黄素计算不低于4000；四种成分各自与相邻峰之间分离度均大于1.5；阴性对照溶液色谱图中，大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚在与对照品相同的保留时间处未出现色谱峰，说明样品中其他成分对上述四个成分无干扰。
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图1 各溶液高效液相色谱图
2.2 性关系考察
结果表明，大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的线性回归方程分别为Y=3.3581×105X-8.0351×104（r=0.9998）；Y=2.5907×105X-8.2471×104（r=0.9996）；Y=3.0452×105X-2.1198×104（r=0.9994）；Y=1.7597× 105X-4.0635×104（r=0.9997）。大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚进样量分别在0.132 08～0.792 48μg、0.087 52～0.525 12μg、0.111 84～0.671 04μg、0.080 16～0.480 96μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.3 复性考察
结果表明，大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量分别为0.6060、0.3980、0.8810、0.2806mg/粒，RSD分别为0.9%、1.2%、0.2%和0.8%，说明本方法具有良好的重复性。
2.4 密度考察
结果表明，大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚色谱峰面积的RSD分别为0.9%、1.5%、1.7%和0.5%，说明精密度良好。
2.5 定性考察
结果表明，大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚色谱峰面积的RSD分别为1.8%、1.2%、0.5%和0.9%，说明供试品溶液在32 h内稳定。
2.6 样回收率试验
从表1可以看出，大黄酸、大黄素、大黄酚、和大黄素甲醚的平均回收率分别为99.32%（RSD= 0.76%）、98.80%（RSD=1.31%）、99.05%（RSD=1.41%）、99.14%（RSD=0.94%）。
2.7 品测定结果
按“1.3.2.2”项下方法制备三批胆石消胶囊供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，记录峰面积，按外标法计算三批样品中大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量。结果表明，三批胆石消胶囊中大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量稳定（表2），本方法适用于胆石消胶囊质量控制方法。
表1 加样回收率试验结果（n=9）
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表2 样品含量测定结果（n=6，mg/g）
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3 讨论
《中国药典》2015年版一部中，大黄药材中总蒽醌含量测定采用先甲醇加热回流后盐酸水解，三氯甲烷回流提取、萃取的方法制备供试品溶液，时间较长，操作步骤多，目标成分容易损耗。本试验则采用甲醇-盐酸（10∶1）混合溶液加热回流同时水解的方法，提取时间较短，操作简单，过程容易控制。本实验前期还对水解温度（70、85、100℃）、提取时间（30、60、90 min）进行了考察，结果以85℃为最佳水解温度，在此条件下加热提取60min即可提取完全。
在配制混合对照品溶液过程中，发现大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚四种对照品在甲醇中的溶解性不够理想，在制备混合对照品储备液时，由于配制浓度较高，对照品不容易溶解，需要超声10min，对照品才能完全溶解。如果在制备混合对照品储备液时不予超声辅助溶解，就有可能因对照品未充分溶解而导致检测结果偏离。
本实验前期还进行了色谱柱的耐用性考察，选择了6种色谱柱（SunFire C18、Kromasil C18、InertSustain C18、Zorbax TC-C18、SymmetryC18、Shima-Pack VPODS）进行测定，其中Symmetry C18、Shima-Pack VPODS两种色谱柱大黄酸与杂质峰不能达到有效分离，在使用Symmetry C18过程中，发现其柱效较高，目标峰与杂质峰完全重合，但是纯度分析显示目标峰为不纯峰，含有杂质。大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚属于弱酸性化合物，不同选择性的C18柱得到了差异性的色谱分离结果，这可能与大黄中蒽醌类成分含有多个酚羟基，在酸性流动相条件下易于与C18柱残留较多的硅羟基或者色谱柱内嵌的极性基团（如酰胺基）相互作用有关。本实验提示，高柱效等于高分离，柱效高的色谱柱不能保证其具备好的分离效果，尤其是弱酸性、弱碱性物质的分离效果，C18柱的类型选择尤为重要［14-15］。
［参考文献］
［1］侯家玉.中药药理学［M］.北京：中国中医药出版社，2002：70-71.
［2］国家药典委员会.中国药典［M］.一部.北京：中国医药科技出版社，2015：23.
［3］许乾丽，茅向军，宋晓宁，等.HPLC法同时测定六味安消胶囊中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量［J］.药物分析杂志，2010，30（10）：1841-1844.
［4］魏玉辉，武新安，陈岚，等.大黄蒽醌类成分含量测定方法实验研究［J］.兰州大学学报（医学版），2005，31（1）：13-15.
［5］李树翠，冯俭，张秋燕，等.采用“一测多评”法测定大黄及其制剂中大黄蒽醌类成分的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（10）：66-71.
［6］李敏，刘渝，李丽霞.大黄配方颗粒总蒽醌含量测定的方法学研究［J］.成都中医药大学学报，2006，29（1）：47-50.
［7］丘小惠，王燕玲，赵瑞芝，等.大黄控释片中四种游离蒽醌和蒽醌甙的含量测定［J］.中药材，2006，29（6）：606-608.
［8］赵萍，王艳坤，黄赵刚，等.高效液相色谱法同时测定中药制剂烧伤膏中芦荟大黄素等5个蒽醌类化合物含量［J］.中国药学杂志，2014，49（8）：688-692.
［9］余积聪，李俊健，吴永成，等.RP-HPLC法测定小儿清热片中大黄5种蒽醌类成分含量［J］.广东药学院学报，2013，29（5）：510-513.
［10］吴永江，陈建军，程翼宇.RP-HPLC同时测定苦黄注射液中4种大黄蒽醌类成分含量［J］.中国中药杂志，2004，29（11）：19-22.
［11］戴作波，张建霞.HPLC法测定自制降脂胶囊中大黄蒽醌衍生物的含量［J］.临床合理用药杂志，2016，9（2A）：95-96.
［12］孟繁颖，方芳，雷力力，等.一测多评法测定复方黄白胶囊中大黄蒽醌类成分的含量［J］.中国执业药师，2013，10（2）：26-29.
［13］许舜军，李鸿燕，曾元儿，等.反相高效液相色谱法测定大黄药材五种蒽醌类成分的含量［J］.时珍国医国药，2006，17（7）：1201-1202.
［14］张伟清，胡昌勤.反相C18液相色谱柱选择性理论及其应用［J］.药学学报，2010，45（5）：555-559.
［15］商国举，尹文龙，蔡振华，等.药物分析中C18色谱柱的差异与选择［J］.药物评价研究，2015，38（3）：341-344.
Determ ination of the contents of four types of anthraquinones in danshixiao capsules via RP-HPLC m ethod
HE Qing-yan1ZHANG Zhi-min2▲LIU Can-huang3
1.Louxing Branch of Loudi Food and Drug Administration，Hunan Province，Loudi 417000，China；2.College of Pharmacy，Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410208，China；3.Loudi Food and Drug Inspection and Detection Centre，Hunan Province，Loudi 417000，China
1.Louxing Branch of Loudi Food and Drug Administration，Hunan Province，Loudi 417000，China；2.College of Pharmacy，Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410208，China；3.Loudi Food and Drug Inspection and Detection Centre，Hunan Province，Loudi 417000，China
［Abstract］Objectiv e To establish the content determination method of rhein，emodin，chrysophanol and physcion in Danshixiao capsules via RP-HPLCmethod.M ethods Waters SunFire C18column（250 mm×4.6mm，5μm）was adopted，andmethanol-0.1%phosphate（85∶15）was selected asmobile phase，with flow rate∶1.0ml/min，column temperature∶28℃，and determination wavelength∶254 nm.Results Sample size of rhein，emodin，chrysophanol and physcion was within the range of 0.132 08-0.792 48μg，0.087 52-0.525 12μg，0.111 84-0.671 04μg，and 0.080 16-0.480 96μg respectively，which showed favorable linear relations with peak areas.The correlation coefficient was 0.9998，0.9996，0.9994 and 0.9997 respectively，the average recovery ratewas99.32%，98.80%，99.05%，99.14%respectively，and RSD was0.76%（n=9），1.31%（n=9），1.41%（n=90），0.94%（n=9）respectively.Conclusion The method is easy to operate，with high specificity，high accuracy and good reproducibility，which is able to be taken as the quality controlmethod of Danshixiao capsules.
［Key words］Reversed phase high-performance liquid chromatography；Danshixiao capsules；Rhein；Emodin；Chrysophanol；Physcion
［中图分类号］R917［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）07（c）-0004-04
［基金项目］湖南中医药大学青年教师科研基金课题（99820001-194）
［作者简介］何清彦（1982-），男，湖南新邵人，硕士，主要从事药物分析研究
▲通讯作者：张智敏（1986-），女，湖北宜昌人，硕士，助理实验师，主要从事药物分析研究
（收稿日期：2016-05-05 本文编辑：卫 轲）