特异乳酸杆菌对人直肠癌裸鼠异种移植瘤细胞增殖的影响
林　蕤　顾　卫　黄　慧
广东省惠州市中医医院药学部，广东惠州　516001
［摘要］目的 探讨特异乳酸杆菌（Lb-f）对人直肠癌裸鼠异种移植瘤模型癌细胞增殖的抑制作用。方法 采用小鼠背部皮下接种人直肠癌系（Colo320）细胞的方法建立裸鼠异种移植瘤模型，并随机分为五组，Ⅰ组作为模型对照组；Ⅱ～Ⅳ组分别以180、360、720mg/kg的Lb-f灌胃，1次/d，灌胃2周。Ⅴ组腹腔注射化疗剂环磷酰胺100mg/kg，1 次/d，共计2周。利用MTT比色法和台盼蓝计数法测定各组的细胞增殖相对抑制率及生长抑制率，并取肿瘤组织，计算瘤重抑制率以及肿瘤生长抑制率，采用ELISA试剂盒测定Bax、Bcl-2、Caspase-3含量。结果随着干预时间的延长，Colo 320瘤块体积有明显变化（P＜0.01），且在开始的48 h内，体积增大不明显，48 h之后，体积增大情况较为明显。体外实验结果显示，各组的细胞增殖相对抑制率和生长抑制率比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；空白对照组和溶媒对照组的细胞增殖相对抑制率和生长抑制率比较，差异无统计学意义；其他组均较前两组高，且阳性药对照组为最高，其次是Lb-f 90组、Lb-f 60组、Lb-f 30组，各组之间的差异均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。在体实验结果显示，各组的细胞瘤重抑制率、肿瘤生长抑制率、肿瘤组织Bax含量、Bcl-2含量、Bcl-2/ Bax、Caspase-3比较，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）；细胞瘤重抑制率、肿瘤生长抑制率、肿瘤组织Bax含量按顺序由低到高分别是Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组，Bcl-2含量、Bcl-2/Bax、Caspase-3按顺序由低到高分别是Ⅴ组、Ⅳ组、Ⅲ组、Ⅱ组、Ⅰ组。结论Lb-f可调节Bcl-2/Bax平衡，从而起到抑制肿瘤生长的作用，且呈剂量依赖性。
［关键词］直肠癌；裸鼠；异种移植瘤；特异乳酸菌
直肠癌（carcinoma of rectum）是消化道最常见的恶性肿瘤之一，由于位置低，易被直肠指诊及乙状结肠镜诊断［1-3］。本病具有位置深入盆腔、解剖关系复杂、手术不易彻底、术后复发率高等特点和难点，近年来发病率逐年增高，且青年人发病率有升高的趋势。目前，临床主要采用手术、放化疗以及免疫治疗等综合治疗手段进行治疗，常用的化疗药物存在选择性低、疗效欠佳、毒性较大和易产生耐药性等缺点［4-5］，因此寻找选择性较高、对正常细胞毒性较低的药物已经成为新的发展方向。特异乳酸杆菌 （Lactobacillus fermentum，Lb-f）是乳酸杆菌中的一种，有文献表明其对机体有免疫调节作用，这可能与其治疗某些疾病存在相关性，而且Lb-f对人结肠癌存在抑制功能。本研究根据人直肠癌裸鼠异种移植瘤模型治疗实验对Lb-f抗人直肠癌的作用进行评价，得到了一些有效数据和结论。
1　材料与方法
1.1　材料
体外培养人直肠癌细胞系Colo320细胞，人直肠癌异种移植瘤突变系BALB/c-nu雌性裸小鼠120只。1.2方法
1.2.1　造模和分组
实验模型：①体外培养人直肠癌细胞系Colo320细胞，用含小牛血清的RPMI-1640培养液37℃恒温培养，CO2浓度5%；当细胞涨势良好，铺满整个瓶壁后，胰蛋白酶消化，进行传代培养，对数生长期用于实验。②调整Colo320细胞浓度1×107/ml，接种于小鼠背部皮下，游标卡尺测量瘤体长、短径，计算初始体积。
1.2.2　细胞增殖抑制率和细胞生长抑制率
1.2.2.1　体外实验　按1×103/孔接种于96孔板中，采用MTT比色法测定细胞增殖相对抑制率 （IR%），IR%= （1-实验组A均值/对照组A均值）×100%，其中A为吸光度；采用台盼蓝活细胞计数法测定细胞生长抑制率。体外实验分组如下：调零组（不加MTT）；空白对照组（等量PBS液）；溶媒对照组（0.2%DMSO）；阳性药物对照组（CTX 20μg/ml）；Lb-f 30组（30μmol/L）；Lb-f 60组（60μmol/L）；Lb-f 90组（90μmol/L）；每组10孔，作用48 h后进行指标测定。
1.2.2.2　在体实验　剔除接种不成功者及体重过小或过大者，纳入100只小鼠进行实验研究，根据体重将其随机分为5组，每组20只。Ⅰ组：荷瘤BALB/c-nu对照组（NS 0.1ml/10 g）；生理盐水灌胃，与Ⅱ～Ⅳ组同步。Ⅱ～Ⅳ组：Lb-f实验组（Lb-f 180、360、720mg/kg）；用生理盐水分别配置180、360、720 mg/kg的Lb-f溶液进行灌胃，每天晨8时，灌胃2周。Ⅴ组：化疗剂环磷酰胺阳性药对照组（CTX）；腹腔注射100 mg/kg，1次/d，共计2周。末次给药或灌胃24 h后脱颈椎处死小鼠，观察瘤体积和瘤重，计算瘤重抑制率和肿瘤生长抑制率。瘤体积：V=L×W2×0.52；瘤重抑制率（%）=（1-实验组瘤重均值/对照组瘤重均值）×100%；肿瘤生长抑制率（%）=（1-实验组瘤体积均值/对照组瘤体积均值）×100%。
1.2.3　细胞增殖的生物学指标
Ⅰ～Ⅴ组取出的瘤体组织，加入9倍重量的生理盐水，电动匀浆器匀浆，配置为10%的匀浆液，以ELISA试剂盒和全自动生化分析仪测定B细胞淋巴瘤因子相关x蛋白（Bax）、细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的含量。ELISA试剂盒均由上海拜力生物科技有限公司提供。1.3统计学处理
采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　Colo 320瘤块接种裸鼠直肠黏膜后肿瘤体积的比较
随着干预时间的延长，Colo320瘤块体积有明显变化（P＜0.01），且在开始的48 h内，体积增大不明显，48 h之后，体积增大情况较为明显（表1）。
表1　Colo 320细胞瘤块接种裸鼠直肠黏膜后肿瘤体积的比较（±s）
与0 h比较，*P＜0.05，#P＜0.01
2.2　各组体外细胞增殖相对抑制率及生长抑制率的比较
体外实验结果显示，各组的细胞增殖相对抑制率和生长抑制率比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。空白对照组和溶媒对照组的细胞增殖相对抑制率和生长抑制率比较，差异无统计学意义，其他组均较前两组高，且阳性药对照组为最高，其次是Lb-f 90组、Lb-f 60组、Lb-f 30组，各组之间的差异均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）（表2）。
表2　各组细胞增殖相对抑制率以及生长抑制率的比较（%，±s）
与空白对照组比较，*P＜0.05，#P＜0.01
2.3　各组在体细胞瘤重抑制率以及肿瘤生长抑制率的比较
在体实验结果显示，各组之间的细胞瘤重抑制率以及肿瘤生长抑制率比较，差异有统计学意义 （P＜0.01或P＜0.05），按顺序由低到高分别是Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组（表3）。
表3　各组细胞增殖相对抑制率以及生长抑制率比较（%，±s）
与Ⅰ组比较，*P＜0.05，#P＜0.01
2.4　各组肿瘤组织Bax、Bcl-2、Bcl-2/Bax、Caspase-3含量的比较
在体实验结果显示，各组之间的肿瘤组织Bax含量比较，差异有统计学意义（P＜0.01），按顺序由低到高分别是Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组。各组之间的Bcl-2含量比较，差异有统计学意义（P＜0.01），按顺序由低到高分别是Ⅴ组、Ⅳ组、Ⅲ组、Ⅱ组、Ⅰ组。各组之间的Caspase-3含量比较，差异有统计学意义（P＜0.01），按顺序由低到高分别是Ⅴ组、Ⅳ组、Ⅲ组、Ⅱ组、Ⅰ组（表4）。
表4　各组肿瘤组织Bax、Bcl-2、Bcl-2/Bax、Caspase-3含量的比较（pg/g，±s）
与Ⅰ组比较，*P＜0.05，#P＜0.01
3　讨论
直肠癌是指处于齿状线到乙状结肠和直肠相交位置之间的癌症［6-8］。在消化道的癌症中，肠癌的发病率仅低于胃癌，约占胃肠道癌症的25.9%，而位于直肠肛管癌中腹膜反折以下的直肠，是癌肿的多发位置，约占75%。早期直肠癌患者在临床上常无症状或症状并不特异，因此无法引发患者以及初次诊治医师的重视。许多患者在发病早期伴有排便习惯发生变化以及便血的现象，出现便频以及排便不尽感。便频和腹泻存在差别，便频仅仅是指次数比正常人多，但是排出粪便的性状无异常或者无较大变化；排便不尽感是指患者排便之后不久又出现便意，但无粪便排出或者是仅排出少量粪便，且间有些许黏液血便，常不引起患者注意。本病一旦发病，将对患者的身心产生一定程度的影响。
直肠癌位置深入到患者盆腔，解剖关系较为复杂，手术难以做到彻底清除，术后的复发概率较高［9-10］。常规化疗药物的选择性低，疗效欠佳，毒性较大，易产生耐药性，因此，发现并开发对直肠癌肿瘤细胞选择性较高、对正常细胞毒性较低的药物迫在眉睫。近年来，由于医学微生态学的不断发展，微生态制剂作为免疫赋活剂已经在防治病症方面获得了较为可喜的成果。乳酸杆菌作为新型生物反应调节剂，具有多种药理作用，具体如下：①黏附于细胞；②具有多种抗肿瘤作用；③安全、无侵袭性、无致癌性、无致病性等。有文献报道显示，乳酸杆菌能减少结肠癌的发生，具有抗突变的作用，可以促进凋亡。Lb-f是乳酸杆菌中的一种，有文献表明其对机体有免疫调节作用，对人结肠癌存在抑制功能。本研究从乳酸杆菌中挑选出Lb-f作为研究对象，评价Lb-f治疗人直肠癌的有效性，旨在为临床应用Lb-f治疗直肠癌提供依据，因此具有广阔的临床应用前景。本研究结果显示，Colo320瘤块接种裸鼠直肠黏膜后肿瘤体积在开始的48 h内无显著性增加现象，体积增大较为明显发生在48 h之后；实验组的细胞增殖相对抑制率以及生长抑制率明显高于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组及Ⅳ组，差异有统计学意义；实验组的细胞瘤重抑制率以及肿瘤生长抑制率明显高于Ⅰ组和Ⅱ组，差异有统计学意义，提示Lb-f对人直肠癌具有一定的抑制作用。Caspase-3是介导细胞凋亡的关键执行分子，在凋亡信号传导途径中发挥重要作用，被称为“死亡蛋白酶”，是细胞凋亡的生物学标志［11-14］。抗凋亡的Bcl-2和促凋亡的Bax是调控细胞凋亡的Bcl-2蛋白家族的重要成员，Bcl-2/Bax的比值与肿瘤凋亡密切相关，决定了促凋亡因子Caspase-3的激活程度［15-19］。本研究中，细胞瘤重抑制率、肿瘤生长抑制率、肿瘤组织Bax含量按顺序由低到高分别是Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组，Bcl-2含量、Bcl-2/ Bax、Caspase-3按顺序由低到高分别是Ⅴ组、Ⅳ组、Ⅲ组、Ⅱ组、Ⅰ组，提示Lb-f对人直肠癌抑制呈剂量依赖性。
综上所述，Lb-f对人直肠癌有抑制作用，且呈剂量依赖性，本研究为临床开发低毒增效的药物（Lb-f）提供了理论和实验依据。
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Influence of Lactobacillus fermentum on xenograft tumor proliferation of human colorectal cancer in nudem ice
LIN Rui GUWei HUANG Hui
Department of Pharmacy，Traditional Chinese Medicine Hospital of Huizhou City in Guangdong Province，Huizhou 516001，China
［Abstract］Oobjective To explore the inhibiting effect of Lactobacillus fermentum（Lb-f）to cancer cells proliferation of human colorectal cancer in nudemouse of xenograft tumormodels.M ethods The xenograft tumormodels of human colorectal cancer in nudemouse were prepared by back subcutaneous injecting Colo320 in mice，and all themodels were randomly divided into 5 group，GroupⅠ　was the control group，GroupⅡ-Ⅳ　were gavaged with Lb-f of 180，360，720mg/kg respectively，one time every day for two weeks，and GroupⅤwas given intraperitoneal chemotherapy cyclophosphamide of 100 mg/kg，one time every day for two weeks.Cell proliferation inhibition rate and growth inhibition rate among each group were detected using MTT colorimetry and trypan blue countingmethod.Furthermore，tumor tissues were extracted to calculate tumor inhibition rate and growth inhibition rate，and the content of Bax，Bcl-2，Caspase-3 was detected by ELISA kit.Results With the extension of intervention time，the volume of Colo320 tumor block was significantly changed　（P＜0.01），and in the beginning of 48 hours，the volume increase was not obvious，after 48 hours，the volume increase wasmore obvious.In vitro experimental results showed that the relative cell proliferation inhibition rate and the growth inhibition rate in each group was compared，and the difference was statistically significant （P＜0.01）.Therewas no statistical difference between the blank control group and the solvent control group，and the other groups were all higher than that the control group and the solvent group，in which the positive control group was the highest，followed by Lb-f 90 group，Lb-f 60 group，Lb-f 30 group，the difference between erery group was statistically significant（P＜0.01 or P＜0.05）.In vivo experiment results showed that there was significant difference in the cell tumor inhibition rate，tumor growth inhibition rate，tumor tissue Bax content，Bcl-2 content，Bcl-2/Bax，Caspase-3 between every group　（P＜0.01 or P＜0.05）.The tumor inhibition rate，tumor growth inhibition rate，tumor tissue Bax content in order from low to high respectively was groupⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，and the Bcl-2 level，the Bcl-2/Bax，Caspase-3 in order from low to high respectively was groupⅤ，Ⅳ，Ⅲ，Ⅱ，Ⅰ.Conclusion Lb-f is able to adjust colorectal antiapoptotic/apoptosis factors （Bcl-2/Bax）balance，which contributes to the inhibiting of tumor growth，and inhibitory effectwas dose-dependent.
［Key words］Colorectal cancer；Nudemice；Xenograft tumor；Lactobacillus fermentum
［中图分类号］R735.3+7
［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）07（b）-0007-04
［基金项目］广东省惠州市科技计划项目（20150809）
（收稿日期：2016-02-29本文编辑：祁海文）