高效液相色谱法测定陈皮健胃片中橙皮苷的含量
谭丽荷
广东省江门市中心医院药剂科，广东江门　529000
［摘要］目的 建立陈皮健胃片中橙皮苷含量的测定方法。方法 采用高效液相色谱法（HPLC），色谱条件为Inertsil ODS-SP（4.6 mm×150 mm，5μm）色谱柱分离，检测波长为283 nm，流动相为乙腈-水进行梯度洗脱，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，理论板数≥3000。结果 橙皮苷进样量线性范围为0.10～2.00μg；在精密度试验、稳定性试验、重复性试验中，橙皮苷峰面积的相对标准偏差 （RSD）为2.06%、2.12%、2.14%；橙皮苷的加样回收率为97.36%～102.39%，平均值为99.29%，RSD为2.06%（n=9）。结论 本法的重现性和专属性良好，加标回收率符合要求，能准确、稳定地对陈皮健胃片中的橙皮苷含量进行定量测定，可作为该制剂的质量控制方法之一。
［关键词］陈皮健胃片；橙皮苷；高效液相色谱法
陈皮健胃片处方源于第四批全国老中医药专家学术继承工作指导老师，硕士生导师余伯亮主任中医师经验方，由广陈皮、山楂、淮山等组成。该方理气和胃，健脾消食，用于脾胃虚弱、消化不良等症。为便于患者服用，丰富临床用药剂型，研制成陈皮健胃片。研究发现，柑橘属植物中含有丰富的黄酮类化合物，有文献［1］报道，橙皮苷是该植物中重要的活性成分，具有清除氧自由基［2］、抗肿瘤［3］、抗病毒［4］、抗炎［5］、降低血脂、保护心血管［6］等多种功效。
橙皮苷含量测定方法有分光光度法［7-8］、荧光光谱法［9］、高效毛细管电泳法［10-11］、高效液相色谱法［12-14］、超高效液相色谱法［15-16］、薄层扫描色谱法［17-18］，为有效控制陈皮健胃片的产品质量，保证安全有效地用药，本研究通过HPLC测定陈皮健胃片中的橙皮苷含量，并对3批自制陈皮健胃片中的橙皮苷进行含量测定。
1　材料与仪器
1.1　材料
陈皮健胃片（批号：20150401、20150410、20150420）由本实验室自制；橙皮苷 （中国药品生物制品检定所）：批号110721-200613；色谱醇甲醇和乙腈。实验用水为双蒸水，所用其他试剂均为分析纯。
1.2　仪器
Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国戴安公司）；CPA225D电子天平　（德国赛多利斯公司）；KQ-300VDE超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；U-3010分光光度计（Hitachi Corp.）。
2　方法与结果
2.1　含量测定指标的确定
陈皮为方中君药，在粤被称为广陈皮或新会陈皮。橙皮苷、黄酮类化合物等为其主要成分。其对某些革兰氏阳性菌、真菌有较好的抑制作用［19］，对小鼠胃排空有促进作用，不会显著影响阿托品所引起的胃排空抑制作用和胃复安所产生的胃排空强化作用［20］；其水煎剂对家兔离体十二指肠梗阻自发活动有较好的抑制作用，能够降低其收缩力，缓解其紧张性，并呈现量效之反应关系［21］。该君药通过对胃肠道平滑肌功能的改变，使胃肠道上端正常运动得以恢复，从而起到健胃作用，故本研究以橙皮苷作为陈皮健胃片质量控制的指标成分，建立了HPLC测定陈皮健胃片中橙皮苷含量的方法。
2.2　色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-SP（4.6mm×150mm，5μm）；流动相：乙腈（A）、水（B）；梯度洗脱：（0～5 min：28% A；5～10min：28%A→35%A；10～18 min：65%A；18～20 min：35%→28%A）；检测波长：283 nm；流速：1.0m l/min；柱温：30℃。
2.3　对照品溶液
将橙皮苷对照品置于P2O5干燥器中干燥1 d后，再精密称取适量橙皮苷于棕色量瓶中，用甲醇作溶剂，使橙皮苷储备液的浓度为0.8mg/ml。使用时逐级稀释为80μg/ml的橙皮苷对照品溶液。
2.4　供试品溶液
取批号为20150401的制剂10片，研磨后过65目筛，精密称取0.6 g于棕色瓶中，加甲醇50.00 ml，称定。在设定的超声条件下超声20min；冷却，称定，用甲醇补足减失的质量，摇匀，用滤膜（0.45μm）过滤，取续滤液，即得。
2.5　阴性对照溶液
取除君药外的处方中其他药材制备缺广陈皮阴性样品，按“2.4”项下方法精密称取0.6 g制备。
2.6　系统适应性试验
分别吸取对照品、供试品、阴性对照溶液各10μl，按“2.2”项进样。在此情况下，橙皮苷能够与其他成分基线分离，橙皮苷的保留值约为3.9 min，理论塔板数＞3000，各成分的分离度均＞1.5；在对照品的橙皮苷出峰位置，阴性对照溶液没有出峰，提示方法的专属性良好，阴性对照也没有出现干扰峰，色谱曲线见图1。
图1　陈皮健胃片中橙皮苷的HPLC图
A.橙皮苷对照品；B.缺广陈皮阴性对照品；C.供试品；1.橙皮苷
2.7　方法学考察
2.7.1　线性范围　精密量取对照品储备液，逐级稀释，得到浓度为10.0、20.0、40.0、80.0、120.0、160.0、200.0μg/ml的橙皮苷系列溶液。每个浓度进样10μl，测定各色谱峰峰面积，结果见表1；再绘制标准曲线，以峰面积均值（Y）为纵坐标，进样量（X，μg）为横坐标，线性回归方程为Y=2305.402X+127.426，r=0.9996。实验表明，橙皮苷的进样量为0.10～2.00μg时有良好的线性关系。
表1　橙皮苷进样量与峰面积关系
2.7.2　精密度　吸取对照品溶液10μl平行测定6次，测定峰面积，平均值为1982.76（RSD=2.06%）。
2.7.3　稳定性　分别在0、3、6、8、9、12 h吸取同一批号（20150401）供试品溶液，进样10μl，用峰面积得到橙皮苷的平均质量。橙皮苷在供试品溶液中的平均质量为6.5071 mg/g（RSD=2.12%），表明在12 h内供试品溶液中的橙皮苷能够保持稳定。
2.7.4　重现性　取6份同一批样品（20150401），各精密称定0.6 g制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件，以峰面积得到橙皮苷的平均质量。结果表明，其平均质量为6.5064mg/g（RSD=2.14%），说明重现性良好。
2.7.5　加标回收率 测定取约相当于橙皮苷6.5071mg/g的同一批号（20150401）陈皮健胃片适量，研细，混匀，称取9份，每份0.5 g，精密称取；分别置于50.00 ml棕色量瓶中，再依次加入橙皮苷储备液 （0.8 mg/ml）2.00、2.00、2.00、4.00、4.00、4.00、6.00、6.00、6.00 ml，再加适量甲醇，超声提取20min，冷却至室温后，再加甲醇定容。0.45μm微孔滤膜过滤，续滤液即为加标回收供试品溶液；分别吸取10μl，进样测定，计算回收率，结果见表2。
表2　回收率试验结果（n=9）
2.8　样品含量测定
按照“2.4”项下方法，取3批中试样品（20150401、20150410、20150420），制备供试品溶液，每批号平行制备3份。按“2.2”项下色谱条件吸取各供试品溶液10μl进样，测定峰面积并计算橙皮苷含量。橙皮苷在3批中试样品中的含量分别为 3.2523、302564、302569mg/片。
3　讨论
3.1　流动相选择
本研究试验了水-醋酸-乙腈、水-甲醇、水-乙腈-磷酸、水-乙腈体系，结果显示，采用乙腈-水体系的流动相，同时应用梯度洗脱方式，橙皮苷能够与其他成分得到良好分离，色谱峰形也比较理想。
3.2　超声时间的选择
在15、20、25 min进行测定，结果提示，20 min时橙皮苷已基本提取完全，故确定时间为20min。
3.3　测定波长的选择
橙皮苷在283 nm波长处有最大吸收，本方法选择在283 nm波长下测定橙皮苷。
综上所述，本研究建立了一种专属性强、简单快捷的定量方法，对陈皮健胃片中橙皮苷的质量控制有一定的参考作用。
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Content determ ination of hesperidin in Chenpi Jianwei tablet by highperformance liquid chromatography
TAN Li-he
Department of Pharmacy，Central Hospital of Jiangmen City in Guangdong Province，Jiangmen　529000，China
［Abstract］Objective To establish a method for the determination of hesperidin in Chenpi Jianwei tablet.M ethods A high performance liquid chromatography　（HPLC）method was established.The chromatographic conditions were as follows：the chromatographic column Inertsil ODS-SP　（4.6mm×150mm，5μm）with themixture of acetonitrile and water asmobile phase in gradientmode，the detection wavelength at 283 nm，the flow velocity of 1.0 ml/min，the column temperature at 30℃，the theoretical plate number no less than 3000.Results The linear relationship between content and peak area was obtained during the range of 0.10-2.00μg for hesperidin.RSD of the peak area of hesperidin for the precision test，the stability test and the repeatability testwas 2.06%，2.12%and2.14%respectively.The recovery rate of hesperidin obtained were in the range of 97.36%-102.39%and the average of 99.29%with RSD of 2.06%　（n=9）. Conclusion Thismethod can be applied to quantitative assay of hesperidin in Chenpi Jianwei tabletwith good specificity and reproducibility.The sampling recovery test is in compliance with the requirement，which can be applied to the quality control of Chenpi Jianwei tablet.
［Key words］Chenpi Jianwei tablet；Hesperidin；High performance liquid chromatography
［中图分类号］R927.2
［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）07（b）-0004-04
［基金项目］广东省江门市科技计划项目（2014020）
（收稿日期：2016-01-15本文编辑：祁海文）