苏年华　李付贵

广东省中山市人民医院肿瘤研究所，广东中山528403

［摘要］目的探讨荧光原位杂交（FISH）技术在检测早孕期自然流产胚胎组织染色体数目异常中的应用价值。方法收集早孕期流产胚胎组织样本396例，使用13/21、16/22及18/X/Y三组特异性DNA探针进行FISH检测，分析7种染色体数目异常的结果。结果396例标本FISH检测均成功，流产胚胎染色体数目异常187例（47.22%）。在异常标本中，XXYY 3例，单倍体4例，三倍体86例，四倍体1例和嵌合体93例；检出频率最高的异常类型是13/21三体/四体（26.20%），其次为16三体（21.93%）和22三体（8.56%），其余类型检出频率均低于5%。孕妇高龄（≥35岁）组染色体异常发生率明显高于非高龄（＜35岁）组。结论通过对早孕期流产胚胎组织进行FISH检测，可以初步了解流产或死胎的原因，对有流产史特别是不明原因反复流产孕妇的再次妊娠和产前诊断具有重要的指导意义。

［关键词］早孕期；自然流产；胚胎；染色体；FISH

随着社会的发展，产前诊断越来越受到重视。在产前诊断过程中，经常有孕妇反映有流产史特别是早期流产史［1］。在所有妊娠中，自然流产占10%～15%，其中有50%～60%的流产是由于早孕期胚胎发育过程中染色体异常所致［2-3］。因此，通过荧光原位杂交（f1uorescence in situ hybridization，FISH）技术检测的流产胚胎组织的染色体异常情况，我们可以了解流产的原因和有效指导再次妊娠。本研究采用13/21、16/22及18/X/Y三组特异性DNA探针，对396例早孕期自然流产的胚胎组织标本进行FISH检测，并对其结果进行分析，探讨FISH技术在查找早孕期自然流产原因中的应用价值。

1.1　一般资料

根据知情同意原则，选择2010年1月～2016年3月396例经中山市人民医院诊断为早孕期自然流产的胚胎组织样本作为研究对象，排除夫妻双方染色体异常、生殖器器质性病变、支原体和衣原体感染、免疫异常、内分泌疾病以及明显的环境污染等因素。根据孕妇年龄分为高龄组（≥35岁）和非高龄组（＜35岁）。

1.2　主要仪器与试剂

O1ympus荧光显微镜，ThermoBrite自动杂交仪，恒温水浴箱，电子分析天平，烤片机，水平离心机；13/ 21、16/22及18/X/Y探针试剂盒均购于北京金菩嘉医疗科技有限公司。

1.3　方法

1.3.1　取材选取在手术室无菌操作清宫手术下取出或自行排出的流产组织标本约10 g，放入已装有20 m1生理盐水的离心管中及时送检。

1.3.2　FISH操作①把流产胚胎组织倒入直径10 cm的培养皿里，用生理盐水冲洗两遍，用眼科剪剪下绒毛，将之尽量剪碎后转移到15 m1尖底离心管中。②加入经37℃预热的0.075 mo1/L KC1 6 m1使劲吹打，置于37℃恒温水浴箱低渗30 min（中间吹打两次）。③加固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）2 m1，轻柔吹打混匀，37℃预固定10 min。④离心去上清，加固定液6 m1再次轻柔吹打混匀，离心弃上清液；再重复固定离心弃上清，然后制备细胞悬液，滴片。⑤75℃烤片30 min后进行FISH实验。⑥杂交后经56℃2×SSC洗涤5 min→0.1% NP40洗涤5 min。⑦取出玻片晾干，加10 U LDAPI复染。⑧在荧光显微镜观察结果，16号、21号、Y染色体在显微镜下呈橘红色荧光信号，13、22、X染色体呈绿色荧光信号，18号染色体呈天蓝色荧光信号。选择背景干净、细胞核内信号大小中等、清晰明亮无重叠、信号间距＞信号直径的细胞，计数200个细胞内FISH的杂交信号，拍照进行图像合成并分析7种染色体数目的情况。判读标准如下：①每组探针计数至少100个细胞；②单独判断每一指标，正常细胞比例＞90%，异常细胞比例均＜10%，提示该指标无异常；③某一指标异常细胞比例＞60%，提示该指标异常；④如果某一指标异常比例介于10%～60%，则加大细胞计数至200个细胞，如实记录异常细胞比例，提示为嵌合体。

1.3.3　统计学方法采用直接计数法统计各异常染色体类型的检出频率；采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1　FISH非整倍体的检测结果

在396例早孕期自然流产的胚胎组织样本中，染色体数目异常187例（47.22%），共检出26种异常类型。187例异常标本中，包括XXYY 3例，单倍体4例，三倍体86例，四倍体1例和嵌合体93例；检出频率最高的异常类型是13/21三体/四体嵌合体（26.20%），其次为16三体（21.93%）和22三体（8.56%），其余类型检出频率均低于5%（表1、图1）。

表1　异常染色体的种类及分布情况（n=396）

 

图1　FISH检测流产胚胎染色体数目情况
A为正常、B为18单体、C为X单体、D为13三体、E为13/21三体、F为13/21三体/四体、G为16/22三体、H为16/22三体/四体

2.2　高龄组与非高龄组胚胎组织染色体异常发生率的比较

高龄组早期自然流产患者80例，其中47例为染色体非整倍体，异常发生率为58.75%；非高龄组自然流产患者316例，其中140例为染色体非整倍体，异常发生率44.30%。两组的染色体异常发生率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2　高龄组与非高龄组胚胎组织染色体异常发生率的比较（n）

2.3　流产次数与胚胎组织染色体异常发生率的比较

初次自然流产185例，染色体异常85例，异常发生率占45.94%，复发性流产（流产次数≥2次）211例，染色体异常102例，异常发生率占48.34%，两组的染色体异常发生率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表3　流产次数与胚胎组织染色体异常发生率的比较（n）

近年来，由于环境因素及高龄妊娠等原因，早孕期自然流产的发生率呈增高趋势，是临床妇产科中最常见的疾病之一，严重影响妊娠妇女的身心健康［4-5］。研究表明，流产胚胎染色体异常占所有自然流产的50%左右，是造成自然流产的主要原因［6］。流产胚胎的遗传学检测方法有核型分析、FISH、PCR、MLPA等技术，但各有优点与不足［7］。细胞遗传学核型分析技术是检测染色体异常的“金标准”，是传统、安全可靠的诊断方法，既能检测46条染色体的数目异常，也能检测结构异常（＞5 Mb），其结果相对直观、可靠与全面；但是，该方法具有一定的局限性，譬如对操作者技术要求高、实验耗时长、培养过程易受污染等［8-9］。相对于细胞遗传学核型分析技术，FISH技术是利用DNA碱基互补配对，把荧光标记的DNA探针和与其互补的目的DNA进行杂交，根据杂交信号的有无及类型来诊断染色体异常类型。该方法无需进行培养，操作简便、快速，既可以分析中期分裂相细胞又可以检测间期细胞，容易被孕妇及其家属接受，并且可较快缓解由于流产带来的焦虑情绪［10-11］。

本研究中，流产胚胎染色体非整倍体异常占早孕期自然流产标本的47.22%，与以往文献［12-13］报道基本符合。导致该异常的原因可能是源自双亲之一方的配子形成时或妊娠初期受精卵卵裂时出现了某号染色体不分离，导致该染色体增多或减少一条，亦即导致三体性或单体性［14-15］。在本研究中，16三体在所有三体型的发病率为47.67%（41/86），与何天文等［16］报道的染色体异常发病率为41.68%接近。此外，在本地区染色体非整倍体异常的187病例中以13/21三体/四体嵌合体最为常见，这可能是由于每个地区判读结果的参考值范围不一样所致。

随着当前社会婚龄和育龄的推迟，加上女性＞35岁机体处于下滑趋势，胎儿畸形的发生率和胚胎染色体非整倍体异常的发生率可能有所增加。在本研究中，高龄组孕妇的流产胚胎染色体异常率与非高龄组孕妇的差异有统计学意义，这跟以往的报道［17］结果是一致的。这可能是由于高龄孕妇体内生殖细胞退化，如卵子质量下降，或者随着年龄的增长，男方精子的数量与质量下降（这一原因往往易被忽视）和其他综合因素等引起胚胎的染色体发育异常所致。

van den Berg等［18］通过对1359例自然流产标本进行细胞遗传学核型分析发现，初次流产的胚胎组织染色体异常发生率显著高于复发性流产，但是在本研究却未发现两者染色体异常发生率差异有统计学意义，有可能是van den Berg所采用的检测方法和本研究所采用的方法不一样或者与本研究病例数少有关。对于流产次数与胚胎组织染色体异常发生率的相关性，我们将进一步研究。

综上所述，流产胚胎组织染色体非整倍体异常是导致早期自然流产的重要原因之一，高龄孕妇的流产风险比非高龄孕妇高。因此，我们应重视并根据FISH检测结果为自然流产孕妇及时提出利于再次妊娠的建议和提供有效的干预。同时，我们也要认识到FISH技术的不足之处，该方法只能检测常见型染色体数目的异常，未能检测其他罕见型染色体异常和结构异常［19-20］。虽然FISH技术无法完全取代传统的染色体核型分析，但是其可以成为绒毛染色体核型分析的一个很好的补充，建议两者结合应用于临床。

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Clinical significance of FISH in diagnosis of spontaneous abortion at early pregnancy

SU Nian-huaLI Fu-gui
Cancer Institute of Peop1e＇s Hospita1 of Zhongshan City in Guangdong Province，Zhongshan528403，China

［Abstract］Objective To discuss the app1ication va1ue of FISH in detecting numerica1 abnorma1ities of chromosomes in embryonic tissue of spontaneous abortion at ear1y pregnancy.Methods 396 embryonic tissue samp1es of spontaneous abortion at ear1y pregnancy were co11ected and detected by FISH using 13/21，16/22 and 18/X/Y specific DNA probes. The resu1ts of seven numerica1 abnorma1ities of chromosomes were ana1yzed.Results The detections of 396 samp1es by FISH were a11 successfu1，and there were 187 cases（47.22%）of numerica1 abnorma1ities of chromosomes.Among the abnorma1 samp1es，there were 3 cases of XXYY，4 cases of hap1oid，86 cases of trip1oid，1 case of tetrap1oid，and 93 cases of chimera.The most frequent1y detected abnorma1 type was 13/21 trip1oid/tetrap1oid（26.20%），fo11owed by 16 trip1oid（21.93%）and 22 trip1oid（8.56%）.The detected frequencies of other types were a11 be1ow 5%.The incidence rate of numerica1 abnorma1ities of chromosomes in the advanced materna1 age（≥35 years o1d）group was significant1y higher than that in the non-advanced materha1 age（＜35 years o1d）group.Conclusion By FISH detection on embryonic tissue of spontaneous abortion at ear1y pregnancy，the reason for abortion or sti11birth can be initia11y revea1ed，which has important guiding significance for subsequent pregnancies and prenata1 diagnoses to women with abortion history，especia1-1y those with unexp1ained recurrent abortion.

［Key words］Ear1y pregnancy；Spontaneous abortion；Embryo；Chromosome；FISH

［中图分类号］R446.8

［文献标识码］A

［文章编号］1674-4721（2016）06（c）-0015-04

［作者简介］苏年华（1983-），男，主管技师，主要从事细胞与分子遗传检验研究

收稿日期：（2016-05-07　本文编辑：方菊花）