彭武建1　谭奎璧2　黄建溶1

1.深圳市第三人民医院肾病科，深圳518000；2.宁波市第二医院肾病科，宁波315000

［摘要］目的了解非IgA系膜增生性肾小球肾炎（MsPGN）患者肾脏组织全基因组微小核糖核酸（miRNA）的表达特征及其作用。方法分别收集6例非IgA MSPGN患者肾穿组织和6例镜下病理检查正常的肾皮质组织作为MsPGN组和NRC组，运用I11umina高通量测序技术分别对其miRNA表达水平进行检测，分析miRNA的表达差异，运用生物信息学技术初步分析其功能。结果在两组样本中具有显著性差异表达的miRNA有139种，其中在非IgA MSPGN组中表达上调的有13种，表达下调的有126种；另外还有20种miRNA在NRC组中特异性表达。生物信息学分析显示这些miRNA靶基因与系膜增生有关。结论非IgA MSPGN患者肾脏组织具有特定的miRNA表达，这些miRNA可能在疾病的发展中具有重要作用。

［关键词］微小RNA；非IgA系膜增生性肾小球肾炎；Illumina测序

系膜增生性肾小球肾炎（mesangia1 pro1iferative g1omeru1onephritis，MsPGN）是我国原发性肾小球疾病中常见的病理类型，病理特征主要为系膜细胞及系膜外基质弥漫性增生，临床主要表现为蛋白尿和（或）血尿，30%的患者表现为肾病综合征［1-3］。microRNA（miRNA）是一种内源性的非编码类小分子RNA，它在转录后具有调控基因的作用，人类体内有近1/3的基因受miRNA调控，并参与生命过程［4-5］。因此，本文通过高通量测序技术对MsPGN患者肾组织全基因组miRNA表达谱进行差异表达分析，探讨MsPGN相关发病机制及寻找新型MsPGN的治疗靶点。

1.1　一般资料

选择我院2014年6月～2015年6月接诊的12例非IgA MsPGN患者，其中男5例，女7例；年龄28～63岁，平均（43.68±9.12）岁；病程16～155 d。MsPGN组选取6例患者的肾皮质穿刺活检组织，样本经过临床、病理及实验室的检查进行综合确诊，排除其他继发性的因素，年龄（44.25±9.79）岁。NRC组选取6例行肾癌根治术患者的癌旁组织，其距肉眼癌团≥3 cm正常肾皮质组织，年龄（43.33±8.55）岁。两组的一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。所用的标本由深圳市人民医院提供，并通过了医院伦理委员会的批准，患者知情且同意。

1.2　样本的处理和总RNA的提取[6]

将取出的样品在液氮中迅速冷冻，冰箱温度保持-80℃，直至送检。于常温下将样品解冻，根据Trizo1试剂盒（Invitrogen）的说明书对总RNA进行提取。样品经分析仪检测合格后（Agi1ent 2000 Bioana1yzer，合格标准RIN≥8.0且28S/18S＞1.5），应用于小RNA（sma11 RNA，sRNA）的建库与I11umina的测序。

1.3　sRNA文库的制备与Illumina测序

分别将两组样本进行同组等量混合，总量要求≥10 μg，用于后期制备sRNA文库。15%PAGE电泳分离并纯化出长度为18～30 nt的sRNA分子，经过RTPCR扩增制备生成sRNA文库，然后用I11umina HiSeqTM2000测序仪对其进行深度的测序。

1.4　sRNA的数据处理和注释

对测序所得到的50 nt长度序列处理后得到干净序列，统计sRNA的种类及数量，进行序列长度分布与样品公共序列统计。使用SOAP 3.0软件比对，得到已知rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA、piRNA、tRNA、mRNA降解片段，重复序列等所占的比例。再将比对后的sRNA序列进一步与miRNA数据库（miRBase 21.0）（http：//www.Mirbase.org/）中人的miRNA序列比对，获取样品中已知miRNA含量，并对丰度等信息进行表达［7］。

1.5　两样本间miRNA的表达差异对比

将两隔样本的miRNA表达进行统一的量归一化，应用Audic and C1averie test的统计方法对表达差异进行对比，计算倍比值和P值［8］。miRNA在两样本间的倍比值≥2且P＜0.001，则认为表达差异有统计学意义。

1.6　novel miRNA预测、差异性表达miRNA的靶基因预测及功能

应用RNAfo1d软件、Mireap和MiPred软件同时对未比对上的sRNA进行预测分析。同时满足两个软件检测条件的sRNA分子则被视为候选的新miRNA基因［9］。应用TargetScan软件（http：//www.targetscan.org/）对差异性表达miRNA靶基因预测并选取相关靶基因运用DAVID功能注释软件（http：//david.abcc.ncifcrf. gov/）［10］和KEGG数据库进行生物信息学分析［11］。

2.1　sRNA测序的数据分析与分类注释

MsPGN组的总序列量为12 024 136条，NRC组的总序列量为14 307 074条，经过处理后MsPGN组有干净序列11 973 505条，NRC组有12 436 226条。其中NRC组的干净序列长度主要集中在19～25 nt，占长度分布频率的87.32%；MsPGN组主要集中在20～24 nt，占长度分布频率的91.28%；干净序列与各类小RNA数据库比对，进行分类注释。在所得的sRNA干净序列文库中，NRC组和MsPGN组所占比例分别为26.97%和62.53%，说明样品的干净序列中大部分为miRNA，表明样品及测序结果的可靠性。

2.2　两组样本miRNA差异表达的比较

两组样本中miRNA具有共同显著性的差异表达的有139例，MsPGN组中表达显示上调的有13例，表达显示下调的有126例（表2）；此外还有20种miRNA在NRC组中特异性表达。倍比值＞50的miRNA见表1。

表1　两组样本miRNA差异表达的比较（Fold change＞50）

 

P-va1ue＜0.001，Fo1d change=MsPGN/NRC or NRC/MsPGN

2.3　novel miRNA的预测

经预测分析后，共得到32个nove1 miRNA结构，其中NRC组和MsPGN组分别为16个，其中6个nove1 miRNA的表达差异有统计学意义（表2）。

表2　两组样本表达具有差异的新miRNAs

2.4　靶基因预测和生物学功能分析

GO的3个本体分别描述了基因的生物学过程（bio1ogica1 process，BP）、分子功能（mo1ecu1ar function，MF）、细胞组分（ce11u1ar component，CC），通过其可观察各种生物学功能在疾病中的作用情况。在非IgA MsPGN患者组织中，我们发现差异miRNA的靶基因主要参与解剖结构发育、细胞代谢过程正调节、多细胞有机体的发育等生物学过程。特别是miR. 101.3p、miR.145.5p和miR.27abc家族富集在多数GO条目中，这些都提示肾脏组织中差异表达的miRNA可能在非IgA MsPGN的疾病过程起重要作用（图1）。

 

图1　显著性差异表达miRNA靶基因GO生物学功能的聚类分析

研究发现了MsPGN样本中呈显著性差异表达有139例miRNAs，其中包括13例miRNAs的表达水平显示上调，126例miRNA的表达水平显示下调。一些已知的miRNA参与肾脏疾病的发病或免疫过程。miR.200家族（miR.200a，miR.200b，miR.200c，miR.141和miR.429）通过抑制ZEB1和ZEB2基因调控间叶细胞与肾小管上皮细胞之间转分化［12-14］。miR.200家族成员抑制纤维化的进程能够通过调控肾小管上皮细胞向间充质细胞转化（epithe1ia1-mesenchyma1 transition，EMT）与其逆转的过程来实现［15］。钙黏蛋白E具有维持上皮细胞功能完整性和极性的作用，其丢失的是EMT的始动环节，使细胞易丧失极性、发生迁移从而转化［16］。miR.200负向调控E-cadherin的影响因子ZEB1和ZEB2，从而使其表达量增高。在本研究中，miR.200a.3p，miR.200b.3p，miR.200b.5p.miR.200c.3p和miR.429表达下调，提示可能与非IgA MsPGN肾小球纤维化有关［17-18］。

本研究中，我们预测了11个新miRNA，只有一个候选miRNA（miR.n.1）疾病组和NRC组表达。通过TargetScan基因预测工具预测发现，该候选miRNA可能是mir486家族成员［19-20］。

综上所述，本研究应用高通量测序技术对MsPGN全基因组miRNA的表达谱进行了研究，成功筛选到一些与MsPGN相关的差异表达的miRNAs，初步探讨了miRNA表达紊乱与该疾病之间的关系。发现了多种差异显著的miRNA可能与MsPGN相关，可作为MsPGN潜在的分子靶点，但其具体作用及相关分子机制仍有待于进一步研究。

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Characteristics of the genome-wide microRNAs expression profiles in non-IgA mesangial proliferative glomerulonephritis

PENG Wu-jian1TAN Kui-bi2HUANG Jian-rong1
1.Department of Nephro1ogy，the Third Peop1e＇s Hospita1 of Shenzhen City，Shenzhen518000，China；2.Department of Nephro1ogy，the Second Hospita1 of Ningbo City，Ningbo315000，China

［Abstract］Objective To investigate the expression characteristics and ro1es of the genome-wide microRNAs（miRNA）in non-IgA mesangia1 pro1iferative g1omeru1onephritis（MsPGN）kidney tissues.Methods Specimens from 6 patients with non-IgA MsPGN were co11ected by biopsy as MsPGN group，and 6 norma1 rena1 cortex specimens were co11ected as NRC group.The miRNA expression was eva1uated by I11umina high-throughput sequencing techno1ogy.And the bio1ogica1 functions of specia1 miRNA were predicted by the prediction software.Results In the MsPGN group，139 miRNA were found to be differentia11y expressed，13 miRNA were up-regu1ated and 126 miRNA were down-regu1ated.Moreover，20 miRNA were specifica11y expressed in NRC group.There was significant difference in miRNA expression between two groups.The bioinformatics showed that the regu1ated target genes of differentia11y expressed miRNA were associated with the mesangia1 pro1iferation.Conclusion The non-IgA MsPGN patients＇rena1 tissues have their own specific miRNA expression profi1es and chromosome distribution characteristics.These miRNA may p1ay an important ro1e in the patho1ogica1 changes of the kidney tissues.

［Key words］MicroRNA；Non-IgA Mesangia1 pro1iferative g1omeru1onephritis；I11umina sequencing

［中图分类号］R692.3+1

［文献标识码］A

［文章编号］1674-4721（2016）06（c）-0004-04

［基金项目］广东省深圳市卫生计生系统科研项目（201402033）

收稿日期：（2016-04-13　本文编辑：方菊花）