魏冬梅1　尹　钢2　刘　锐1　王　蔷3　王超男1　邱学荣3▲
1.齐齐哈尔市第一医院个体化医学诊疗中心，齐齐哈尔　161005；2.齐齐哈尔市中医医院制剂室，齐齐哈尔　161000；3.齐齐哈尔市第一医院脑卒中科，齐齐哈尔　161005

［摘要］目的 针对性地收集齐齐哈尔脑卒中患者的生物样本，构建标准化、高质量的脑卒中生物样本库，为齐齐哈尔市脑卒中疾病数据分析和临床决策提供样本资源和数据支撑平台。方法 制订标准化操作流程，筛选入库对象，收集符合标准的患者血清、血浆、白细胞及从白细胞中提取的DNA和RNA，保存于-80℃冰箱或液氮中，进行DNA和RNA质量鉴定，确保提供高质量的临床样本资源。结果 从2013年起，该样本库已收集753例患者，收集血清、血浆样本各3008份，白细胞2253份，DNA、RNA样本各3770份。电泳结果显示，RNA电泳均出现18S和28S两条带，无弥散现象，且28S条带亮度约为18S条带亮度的2倍，DNA电泳条带清晰，完整性良好。结论 初步建立了标准化、高质量的齐齐哈尔地区脑卒中生物样本库，以进一步探索和利用脑卒中样本资源，为今后脑卒中患者个体化治疗提供帮助。

［关键词］脑卒中；生物样本库；齐齐哈尔

［Abstract］Objective To targeted collect the biological samples of patients with cerebral apoplexy in Qiqihar，to construct a standardized biological sample bank of cerebral apoplexy with high quality and provide sample sources and data supporting platform for the data analysis and clinical decisions for cerebral apoplexy in Qiqihar.Methods The standardized operative process was made，the object was selected，blood serum，blood plasma，white cells，DNA and RNA extracted from the white cells of the standardized patients were collected and stored in the refrigerator at-80℃or liquid nitrogen.The quality of DNA and RNA was detected so that clinical sample sources with high quality were to be provided.Results From 2013，a total of 753 patients were enrolled in the sample bank.Samples of blood serum and blood plasma were 3008 respectively，white cells were 2253 and DNA and RNA were 3770 respectively.The results of electrophoresis showed the RNA electrophoresis had both 18S and 28S stripes without dispersion and the lumen of 28S stripe was as twice as that of the 18S stripe.DNA electrophoresis had clear stripes with good integrity.Conclusion The standardized biological sample banks of cerebral apoplexy with high quality in Qiqihar is primarily established to further explore and apply the data sources of cerebral apoplexy，which can provide help for individualized treatment of patients with cerebral apoplexy in the future.

［Key words］Cerebral apoplexy；Biological sample bank；Qiqihar

脑卒中是齐齐哈尔地区的高发疾病，严重危害人类健康，具有高发病率、高复发率、高致残率和高致死率的特点［1］。2008年原卫生部发布的《我国居民第三次死因回顾抽样调查报告》指出，脑血管疾病已成为导致我国居民死亡的首要原因，其中以脑卒中造成的损害为重［2］，给患者家庭和社会带来了沉重的负担。

近年来，临床研究人员逐渐意识到样本资源对于科研工作的重要性，开始重视临床生物样本的大量收集和规范化的管理工作［3-5］。从2013年起，本院开始收集样本，建立脑卒中患者的生物样本库，旨在为今后的医学研究提供珍贵的临床样本资源。样本库的建立有助于探索脑卒中的发病机制，为脑卒中的临床治疗提供帮助。

1.1主要设备

小液氮罐，-80℃超低温冰箱（三洋MDF-U73V型），低温高速离心机（Thermo MICRO21R型），纯水机（Milli-Q Reference），生物安全柜（海尔HR60-iiA2型），凝胶成像系统（UVP GelDoc-ITTS2型），微量核酸蛋白检测仪（ND2000型），涡旋振荡器（Vortex-Genie 2T型）。

1.2主要试剂

PBS缓冲液（北京索莱宝科技有限公司P1010），红细胞裂解液（QIAGEN79217），DNA提取试剂盒（碧云天生物技术研究所D0063），Trizol（Thermo Fisher 15596-026），样本稳定剂（Ambion AM7020），氯仿（上海金穗生物科技有限公司67-66-3），异丙醇（济宁铭达新材料有限公司67-63-0），80%乙醇（济宁华凯树脂有限公司64-17-5）。

1.3研究对象

以填表的形式对脑卒中患者进行流行病学调查，调查内容如下。①患者的一般情况：姓名、年龄、性别、民族、居住地址、文化程度及工作类别等；②疾病史：高血压、冠心病、肾病、糖尿病、脑卒中等既往病史及家族病史；③生活习惯：是否吸烟、喝酒或长期食用高盐或腌制品等；④临床信息：患者主诉、脑卒中亚型、并发症以及各类卒中相关评分等，根据调查情况确定入库对象。

1.4血液样本的采集及处理

筛选符合标准的脑卒中患者，签署知情同意书，采集患者空腹静脉血至抗凝管及非抗凝管中，2000 r/min离心10 min，吸取上清液分装，上清液分别为血浆和血清，置于-80℃冰箱或液氮中储存。取抗凝管中层液体到10 ml离心管中，加入5 ml红细胞裂解液，置于摇床充分混匀，2000 r/min离心10 min，弃去上清，重复2次，所得沉淀用PBS洗涤并分装，即得白细胞，加入样本稳定剂，4℃过夜充分渗透后冻存于-80℃冰箱或液氮中。

1.5 RNA和DNA的提取及鉴定

1.5.1 RNA提取及鉴定　1 ml Trizol吹散白细胞沉淀，加入200 μl氯仿离心20 min，吸取上清到装有560 μl冷异丙醇的EP管中混匀，常温静置1 h，4℃，12 000×g离心10 min，弃去废液，加入1 ml 80%乙醇，8000 g离心3 min，弃去废液，重复该步骤一次，所得沉淀即为RNA，用RNase-free H2O溶解，分装后置于-80℃冰箱或液氮中冻存。

取1 μl提取后产物，用微量核酸蛋白检测仪检测RNA的浓度及纯度，1%琼脂糖凝胶电泳后观察其完整性。

1.5.2 DNA提取及鉴定　DNA提取方法按DNA提取试剂盒说明书进行，产物分装后置于-80℃冰箱或液氮中冻存。

取1 μl提取后产物，用微量核酸蛋白检测仪检测DNA的浓度及纯度，2%琼脂糖凝胶电泳后观察其完整性。

1.6存储样本的定期抽检

每年对样本进行抽样检测，按约1/500的比例随机抽取，通过微量核酸蛋白检测仪检测核酸的浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA和RNA样本的完整性。

2.1样本的收集

脑卒中生物样本库于2013年开始建立，现已初步形成标准化、规范化的样本采集、处理、保存流程及管理、质量控制体系，共收集血清、血浆样本各3008份，白细胞2253份，DNA、RNA样本各3770份。

2.2 DNA质量鉴定

所提取的基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1，DNA电泳条带清晰，完整性良好无降解现象。使用核酸蛋白检测仪检测，光密度OD260/OD280值为1.8～2.0，提示无RNA和蛋白污染。

 

图1　DNA琼脂糖凝胶电泳图

2.3 RNA质量鉴定

所提取的RNA样本经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2，可见清晰的18S和28S两条带，且28S条带亮度约为18S条带亮度的2倍。使用核酸蛋白检测仪检测，光密度OD260/OD280值为1.7～2.0，提示RNA提取质量良好，无降解且纯度高。

 

图2　RNA琼脂糖凝胶电泳图

2.4样本储存质量鉴定

微量核酸蛋白检测仪和琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，所抽检的DNA和RNA样本未出现降解等现象，浓度及纯度与未冻存前相比无显著差异，样本保存质量良好（图3、图4）。

 

图3　DNA琼脂糖凝胶电泳图
A.冻存前样本DNA电泳图；B.冻存后样本DNA电泳图

 

图4　RNA琼脂糖凝胶电泳图
A.冻存前样本RNA电泳图；B.冻存后样本RNA电泳图

脑卒中是一组以脑组织缺血及出血性损伤为主要临床表现的脑血管病［6］，影响因素很多，因此对脑卒中患者的数据信息进行规范化管理十分重要。一个优秀的样本库信息化管理体系的建立能够带来重要的科研价值［7-8］。目前，国内已建起不同规模的脑卒中数据库，如新疆石河子市人民医院建立的新疆地区脑卒中数据库［9］、湖南湘潭市第二人民医院建立的湘潭地区脑卒中数据库［10］等。研究人员可利用数据库资源，探索并总结其发病的现状及特点，为脑卒中的预防和治疗提供可靠依据，这对规范和提高该地区脑血管病的整体诊治水平具有重要作用。近年来，随着分子生物学的快速发展，相关医学研究［11-13］显示，疾病的发生大多与基因相关。生物样本作为进一步基因水平研究及个体化诊疗（personalized medicine）的基础［14］，是不可再生的珍贵资源。目前，本院的脑卒中样本库已初步建立，样本库的操作规范、伦理程序、信息管理体系的建设及样本的存储程序等已基本成熟，从2013年开始，共收集血清、血浆样本各3008份，白细胞2253份，DNA、RNA样本各3770份，建立了标准化、高质量的脑卒中生物样本库，为脑卒中更深入的研究提供了基础。

高质量的生物样本是获得可靠研究数据的基础［15］，为新诊断指标的发现及新药的研发提供了保障，对人类疾病个体化预测、诊断、治疗的研究具有重要意义［16］。本院生物样本库制订了一套完整的样本质量管理体系，技术人员上岗前需经过严格的系统培训，从血液样本的采集到样本的运送、处理、保存及信息管理均能熟练掌握；定期进行规范操作培训和考评，确保每个环节都能得到有效的执行。血液样本采集后如不能马上处理，需先置于4℃冰箱内保存，在3～5 h内分离血清、血浆，否则会导致细胞结构变化和核酸蛋白降解。目前对血清、血浆等血液类样本没有特别理想的通用质量检验方法，整个流程严格的质量控制是主要的质量保证手段［17］。定期随机抽样及样本用户的质量信息反馈对于样本质控也具有重要意义［18］。抽样结果及反馈意见能及时发现问题，进而制订相应的纠正措施。如果是技术人员的操作问题，应重新进行规范操作培训；如果是流程方法问题，应及时进行优化改进，进一步保证样本质量。本研究结果显示，抽检样本的DNA条带完整清晰，无拖尾现象，提示DNA样本保存完好，无降解；RNA条带的28S、18S清晰可见，提示RNA完整性好，无明显降解；抽样检测结果证明本院脑卒中生物样本库DNA、RNA保存完好，可满足大部分实验要求，也证明根据本院的标准化操作流程，收集的样本质量可以得到保证。

目前，生物样本库的建设受到了广大科研工作者的重视，已建立了不同病种的生物样本库［19-20］，但仍存在一些问题，如个别样本库操作不够规范、流行病学资料缺乏或缺失等，并且大多数生物样本库都是独立存在的，能够满足为科研提供样本的基本需求，但还不够灵活、全面地对生物样本库进行最有效合理的应用［14］。齐齐哈尔地区脑卒中样本库这一资源平台，不只是满足自身研究的需要，更要寻求国内及国际间的合作交流，为其他科研工作者提供高质量的样本，更好地实现对外交流，最大程度地促进转化医学的发展。

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Establishment and quality detection of biological sample bank of cerebral apoplexy in Qiqihar

WEI Dong-mei1YIN Gang2LIU Rui1WANG Qiang3WANG Chao-nan1QIU Xue-rong3▲
1.Individualized Clinic Center，the First Hospital of Qiqihar City，Qiqihar　161005，China；2.Manufacturing Laboratory，Qiqihar Hospital of Traditional Chinese Medicine，Qiqihar　161000，China；3.Department of Cerebral Apoplexy，the First Hospital of Qiqihar City，Qiqihar　161005，China

［中图分类号］R743.3

［文献标识码］A

［文章编号］1674-4721（2016）06（a）-0008-04

［基金项目］黑龙江省齐齐哈尔市社会发展指令性计划项目（SFGG-201411）

［作者简介］魏冬梅（1979-），医学博士，副主任中医师，黑龙江中医药大学博士后，技术专长：心、脑常见疾病的中西医结合治疗以及亚健康状态的中医药调理

（收稿日期：2016-01-12 本文编辑：祁海文）