于洪君 孙晓玲 李彩虹 程东凯 刘 吉 李宝山
沈阳东方医疗集团菁华医院生殖实验室，沈阳 110005

［摘要］目的评估常规体外短时受精失败后补行卵胞浆内单精子注射（ICSI）的胚胎发育情况和临床妊娠结局。方法回顾性分析2012年1月～2013年12月在我院行ICSI治疗的1032个新鲜移植周期，其中687个ICSI周期因单纯男性因素不育行ICSI治疗为对照组；345个ICSI周期为常规体外受精（IVF）在短时受精完全失败后行早补救性ICSI为实验组。比较两组的胚胎发育情况和临床妊娠结局。结果实验组正常受精率（61.4%）显著低于对照组（77.2%），优质胚胎率（58.5%）显著高于对照组（48.1%），差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组和对照组的异常受精率（4.9%vs 4.8%）、卵裂率（98.6%vs 97.7%）、临床妊娠率（40.9%vs 43.8%）、胚胎种植率（25.5%vs 28.6%）、流产率（18.1%vs 21.3%）、异位妊娠（1.4%vs 2.0%）和多胎分娩率（28.8%vs 27.7%）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。实验组分娩111例，获新生儿143名，对照组分娩231例，获新生儿295名（包括3名死产），两组新生儿早产率（13.5%vs 14.3%）、低出生体重（LBW）率（21.7%vs 20.1%）和出生缺陷率（2.1%vs 1.7%）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论常规IVF受精失败后，行早补救ICSI可明显提高受精率和优质胚胎率，并获得满意的临床妊娠结局。

［关键词］体外受精；补救卵胞浆内单精子注射；胚胎发育；妊娠结局

受精失败在常规体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）周期中的发生比例报道不同，大多数的报道在10%～15%，包括部分受精失败（受精率＜25%）和完全受精失败［1］。此类患者会因受精率低，可移植胚胎形成率降低，周期妊娠率大大降低，甚至因完全受精失败而放弃周期移植。为早期发现上述两种情况并使此部分患者得到及时补救，目前一些生殖中心采用了短时受精结合早期补救ICSI的方法，即授精后5～6 h行补救ICSI，尽量避免IVF周期完全受精失败或部分受精失败，有效降低周期取消率，同时获得更多可用胚胎，增加了患者妊娠机会。然而与常规ICSI周期比较，短时受精结合补救ICSI的ICSI操作时间往往要滞后5～6 h，卵子在体外孵育的时间明显延长，这是否会影响ICSI后的胚胎发育和妊娠结局，有研究［2-4］表明，体外受精5～6 h后，大部分卵母细胞已经趋于老化，错过了受精最佳时机，此时行补救ICSI，虽然可以受精，但是会影响维持胚胎卵裂的一些细胞因子或信使RNA（mRNA）原有的功能，进而可能影响胚胎发育潜能。因此有必要对补救ICSI的安全性进行评估。

1.1 一般资料

选取2012年1月～2013年12月在我院行ICSI治疗的1032个新鲜移植周期为实验对象。其中单纯行ICSI治疗的为对照组，共687个周期，主要以男性严重的少弱畸形精子症、不射精、逆行射精等不育因素进入治疗周期。接受常规IVF-ET治疗，完全不受精行早期补救ICSI的为实验组，共345个周期，不孕病因为输卵管因素，多囊卵巢，排卵障碍，子宫内膜异位症，男方轻度少弱畸形精子症及原因不明不孕等。

1.2 方法

1.2.1 卵巢刺激及取卵采用我院应用的常规长方案、短方案或拮抗剂方案控制行卵巢刺激，当至少有2个优势卵泡直径达到20 mm，并结合雌激素的水平，肌注绒毛膜促性腺激素（HCG）5000～10 000 IU后36～38 h，在B超引导下经阴道后穹隆穿刺取卵。

1.2.2 精子获取及处理患者取卵前禁欲3～7 d，取卵日留取精液标本，采用密度梯度离心法处理精液，调整精液密度。

1.2.3 授精方法 两组授精时间通常在取卵后3～4 h。常规IVF为将制备好的精子加入到含有卵子的受精培养液中，每1.0 ml受精培养液大约加入（10～15）万条精子。精、卵共培养3～4 h后剥除卵周颗粒细胞，观察MⅡ期卵是否排出第二极体，排出第二极体的卵认为受精，未排出第二极体的卵认为未受精，继续观察2 h，如未受精卵数占成熟卵比例＜30%行补救性ICSI术。本研究为确保两组移植的胚胎均来自ICSI后，因此仅将完全不受精行早期补救性ICSI的周期选入实验组。采用本实验室操作常规行ICSI。

1.2.4 受精、胚胎发育及妊娠的评估ICSI后第1天观察受精，正常受精可观察到双原核（2PN）。取卵后第3天根据卵裂球大小、是否均匀及有无碎片和发育速率进行胚胎质量评估，选择最优质胚胎2～3个进行移植，移植后2周测血HCG，如阳性，则为生化妊娠，于移植后5～7周测血βHCG升高，B超检查显示妊娠囊、见胎心搏动则为临床妊娠。

1.2.5 妊娠结局随访 记录妊娠的经过、分娩时间、有无并发症，新生儿的性别、体重及有无出生缺陷。流产是妊娠不足28周而终止者；异位妊娠为受精卵在子宫体腔以外着床，包括宫内外同时妊娠；早产是妊娠满28周不足37周间分娩者；低体重儿是指新生儿出生体重＜2500 g；出生缺陷是出生时存在需外科矫正或引起功能障碍的缺陷。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，计数资料用百分率（%）表示，采用X2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 两组患者一般资料的比较

实验组和对照组患者的年龄、不孕年限、基础促卵泡生成素（FSH）、移植日子宫内膜厚度及获取卵子数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1），具有可比性。

2.2 两组胚胎发育、妊娠结局及新生儿出生情况的比较

实验组的正常受精率显著低于对照组（61.4%vs 77.2%）（P＜0.05），而优质胚胎率显著高于对照组（58.5%vs 48.1%）（P＜0.05）。两组用于受精的ICSI卵子数、异常受精率、卵裂率、移植胚胎数、临床妊娠率、胚胎种植率、流产率、异位妊娠发生率及多胎分娩率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。实验组分娩新生儿143个，对照组分娩新生儿295个（包括3例死产），两组新生儿的早产率、LBW率和出生缺陷率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2、表3）。

随着IVF-ET技术的广泛应用，越来越多的不孕不育夫妇通过此项技术获得自己的后代。但是在目前常规IVF周期中仍有5%～10%会发生受精完全失败［5］，使得患者由于没有可移植胚胎而不得不放弃本周期的治疗，承受着巨大的心理及经济压力，同时也增加了临床医生的心理压力。受精是雌雄配子结合形成合子的过程，其涉及精子和卵子之间一系列复杂的相互作用，包括精子获能，精卵识别，发生顶体反应并穿过透明带，精子与卵子质膜融合，激发卵发生皮质反应，恢复减数分裂，雌雄原核形成，完成受精［5］。任何一个受精环节发生异常均可导致受精失败。虽然体外受精前会进行精液分析、精子功能检测，然而即使这些检测结果正常，仍不能准确预测受精结果。

如何预防和避免IVF周期因为不受精而放弃胚胎移植，一直以来是辅助生殖领域的研究重点。受精失败后行补救ICSI是针对此种情况采取的主要措施，其中包括两种补救方式，即晚补救和早补救。晚补救ICSI即常规IVF受精后16～18 h观察雌雄原核判断受精，对不受精的成熟卵行补救ICSI，尽管可获得较好的受精率和卵裂胚胎，但是移植后临床妊娠率及胚胎种植率低，流产率很高。主要原因包括卵子培养过程中老化；胚胎发育时期与内膜发育不同步；精子卵子长时间共培养，精子产生的大量代谢产物可能造成卵子透明带变硬或原核DNA损伤［6-8］。晚补救ICSI临床应用意义不大，已很少应用。目前应用较多的是早补救ICSI，即在常规IVF受精后5～6 h，通过观察第二极体的排出作为早期判断受精与否的标准，对无第二极体排出的成熟卵母细胞实施补救ICSI。正常人体自然受精过程中精卵共同孵育20 min内即可完成受精排出第二极体，因此理论上讲，受精在精卵相遇后短时间内即可完成。有研究报道，常规体外受精，卵子受精通常在加精后2～4 h完成，受精6 h后大约90%的受精卵排出第二极体［9-11］。南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学科是我国较早开展早补救ICSI的中心，其研究报道体外受精3 h后即有78.7%的卵母细胞排出第二极体，6 h后第二极体排出率可增加到92.9%［1］。早补救ICSI在提高受精率和可用胚胎率的同时未降低胚胎质量，增加了胚胎冷冻率和累积妊娠率，极大地降低了周期取消率，获得较好的临床结局［12-14］。

本研究结果显示，实验组的正常受精率明显低于常规ICSI组，而优质胚胎率明显高于对照组，差异有统计学意义，与相关研究结果相近［14］。常规IVF中，卵子受精失败原因有精子因素和卵子因素。导致实验组正常受精率低的原因主要考虑卵母细胞本身存在受精功能低下，如卵母细胞的胞核和胞质成熟不同步、皮质颗粒排放及分布异常、透明带异常及卵母细胞激活失败等［15-17］。另外，也不能排除卵子体外培养时间延长对卵子受精能力的影响。实验组优质胚胎率明显高于对照组，考虑两组男性精液情况的不同是导致优质胚胎率有显著性差异的主要原因。在实验组，男方精液常规分析多为正常或轻度异常，受精失败多为受精功能障碍导致的，一旦解决受精，对胚胎发育及胚胎种植的影响较小。而在对照组，不孕病因多为男性因素不育，精液常规检查为严重的少弱畸形精子症，存在精子发生及功能异常，其可能影响受精后的胚胎发育质量。

相关研究［18］认为，IVF短时补救ICSI的异常受精率高于常规ICSI。而本研究中，两组异常受精率无显著差异，考虑本研究中的实验组选择的病例是IVF完全不受精，患者本身可能存在精卵受精障碍。而且随着体外受精技术的不断发展，临床促排卵技术日趋完善，补救ICSI的成熟卵母细胞成熟度较接近，受精后6 h，90%以上的受精卵排出了第二极体，由于受精判断失误引起的异常受精比率下降。另外，早期补救ICSI依赖于早受精的准确判断，实验室技术人员的经验也是影响判断结果的非常重要因素。

本研究两组间妊娠结局和新生儿情况比较，短时补救ICSI可获得与常规ICSI相近的临床妊娠率和种植率，两组流产率，异位妊娠发生率以及多胎率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。尽管有学者认为实施补救ICSI会增加胎儿异常发生率［19］，但本研究结果显示，两组新生儿在早产、低出生体重和出生缺陷发生等方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05），与张宁媛等［20-21］的研究结果一致。

综上所述，常规IVF短时受精结合早补救ICSI未影响ICSI后的胚胎发育，可以获得与常规ICSI相近的妊娠结局，未增加新生儿出生缺陷风险。早补救ICSI能有效降低周期取消率，提高周期累计妊娠率，减轻就医患者经济负担和心理负担，具有良好的社会效益。

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Clinical outcomes of adding ICSI after short time fertilization fail

YU Hong-jun SUN Xiao-ling LI Cai-hong CHENG Dong-kai LIU Ji LI Bao-shan
Reproductive Medical Lab，Shenyang Oriental Medical Group Jinghua Hospital，Shenyang 110005，China

［Abstract］Objective To evaluate the embryonic development situation and clinical pregnancy outcome of adding ICSI after routine short time in vitro fertilization fail. Methods 1032 fresh migration cycle，conducted ICSI from January 2012 to December 2013 of our hospital were analyzed retrospectively.687 ICSI cycle，conducted ICSI treatment resulted from pure male factor infertility，were selected as control group，and 345 ICSI cycle，adding ICSI after routine short time in vitro fertilization fail，were selected as experimental group.The embryonic development situation and clinical pregnancy outcome between two groups were compared. Results The normal fertilization rate in experimental group was 61.4%，obvious lower than that was 77.2%in control group，the good quality embryos rate was 58.5%，obvious higher than that was 48.1%in control group（P＜0.05）.The abnormal fertilization rate，cleavage rate，clinical pregnancy rate，embryo implantation rate，abortion rate，incidence of ectopic pregnancy and more births between experimental group and control group were respectively（4.9%vs 4.8%），（98.6%vs 97.7%），（40.9%vs 43.8%），（25.5%vs 28.6%），（18.1%vs 21.3%），（1.4%vs 2.0%）and（28.8%vs 27.7%），all of that had no statistical significance（P＞0.05）.111 were delivery in experimental group and got 143 newborns，which were respectively 231 and 295（included 3 dead-birth）in control group.The neonatal preterm birth rate，LBW rate and birth defects rate between two groups were respectively（13.5%vs 14.3%），（21.7%vs 20.1%）and （2.1%vs 1.7%），and all of the difference had no statistical significance（P＞0.05）. Conclusion After fail from the routine IVF，fertilization，adding early ICSI can enhance fertilization rate and good quality embryos rate obviously and can get satisfactory clinical pregnancy outcome.

［Key words］In vitro fertilization；Adding ICSI；Embryonic development；Pregnancy outcome

［中图分类号］R713.7

［文献标识码］A

［文章编号］1674-4721（2016）04（b）-0088-04

收稿日期：（2016-01-16 本文编辑：王红双）