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1.广西医科大学附属肿瘤医院病理科，南宁 530021；2.广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部，南宁 530021

［摘要］目的检测不同分子亚型乳腺癌患者外周血淋巴细胞亚群的变化，探讨其与临床病理特征的关系。方法选取广西医科大学附属肿瘤医院2013年1～12月就诊收治的206例女性乳腺病患者，随机将其分为166例乳腺癌组（观察组，n=166）及40例正常健康组（对照组，n=40），观察组采用免疫组化Envision二步法检测雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体-2（HER-2）、Ki-67的蛋白表达情况并进行分子分型，后采用流式细胞仪法测定两组的外周血各淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD16+CD56+、CD19+的活性，结合临床和病理特征资料进行比较分析。结果在Luminal A型、Luminal B型及HER-2过表达型中，CD3+活性、CD4+/CD8+比值与正常健康组比较均下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；在4种分子亚型中，CD4+、CD19+活性与正常健康组比较均下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；三阴性型的NK（CD16+CD56+）活性与正常健康组比较下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。组织学Ⅱ级的CD4+活性明显低于组织学Ⅰ级，两者比较差异有统计学意义（34.35±9.03 vs 38.12±8.75，P＜0.05）；组织学Ⅲ级的NK（CD16+CD56+）活性明显低于组织学Ⅱ级，两者比较差异有统计学意义（13.92±6.34 vs 16.15±7.98，P＜0.05）。有淋巴结转移的患者CD4+活性及CD4+/CD8+比值均低于淋巴结无转移的患者，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论外周血淋巴细胞亚群的测定对于了解不同分子亚型的乳腺癌患者机体免疫功能的状态有一定的意义，有助于病情观察、疗效监测、预后判断。

［关键词］乳腺癌；淋巴细胞亚群；分子分型；临床病理特征

▲通讯作者

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，好发于中老年女性，近年来乳腺癌发病率和死亡率呈逐年上升的趋势［1-2］。乳腺的发病率和死亡率受多种因素的影响，如患者的年龄、种族、心理因素以及肿瘤的大小、组织分级、临床分期等［3］。近年来，乳腺癌分子分型的研究已成为临床研究的热点，Perou等［4］提出的乳腺癌分子分型指出乳腺癌个体间的临床特点及预后存在差异。近年来关于细胞免疫与乳腺癌的发生、治疗及预后之间关系的研究不断地深入，这对于减少乳腺癌的发病，控制乳腺癌的复发和转移，优化现有免疫治疗手段等有着极为重要的意义。本文研究不同分子亚型乳腺癌与外周血中淋巴细胞亚群及临床病理特征的关系，分析其与乳腺癌发生发展的关系及临床意义。

1.1 一般资料

选取广西医科大学附属肿瘤医院2013年1～12月就诊收治的206例女性乳腺病患者，随机将其分为166例乳腺癌组（观察组，n=166）及40例正常健康组（对照组，n=40）。其中乳腺癌组166例中，年龄46～77岁，平均年龄57岁，患者均为女性，未进行术前新辅助放化疗，无免疫系统疾病，未使用影响机体免疫功能的药物，无严重心、肝、肾、肺等重要脏器疾病及内分泌紊乱；对照组40例女性均为健康体检者，年龄32～56岁，平均年龄46岁。本研究经相关医学伦理委员会批准，参与研究者均知情同意。

1.2 分子分型

入组的乳腺癌病例根据免疫组化Envision二步法检测雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体-2（HER-2）、Ki-67四种蛋白的表达情况，分子分型按照第13届St.Gallen国际乳腺癌会议共识分成4个亚型。①Luminal A型（腔面A型）：ER+和（或）PR+，HER-2-，Ki-67＜14%；②Luminal B型（腔面B型）：包括HER-2阴性组及HER-2阳性组，其中HER-2阴性组为ER+和（或）PR+，HER-2-，Ki-67≥14%，HER-2阳性组为ER+和（或）PR+，HER-2+，Ki-67任何水平；③HER-2过表达型：ER-、PR-、HER+、Ki-67任何水平；④三阴性型：ER-、PR-、HER-、Ki-67任何水平。

1.3 流式细胞术

抽取乳腺癌患者治疗前清晨空腹肘静脉血2 ml，置于含EDTA-Na2试管中，吸取50 μl分别与荧光素标记的鼠抗人单克隆抗体CD45/CD4/CD8/CD3，CD45/CD（16+56）/CD19/CD3各20 μl混匀，室温避光反应30 min，每管加溶血素600 μl，充分混匀，避光15～30 min，1 h内流式细胞仪（美国BD公司）检测，根据前向和侧向散射光双参数点图，设“门”于白细胞共同抗原（CD45）阳性细胞和T细胞共同抗原（CD3）阳性细胞，计数5000个淋巴细胞，双参数分析淋巴细胞表面标记，计算出CD3+、CD4+、CD8+、CD16+CD56+、CD19+细胞表达活性。

1.4 观察指标及评价标准

详细记录两组的外周血各淋巴细胞亚群免疫学指标CD3+、CD4+、CD8+、CD16+CD56+、CD19+的活性。ER、PR蛋白阳性表达是根据2012年美国临床肿瘤学会（ASCO）制定的标准判断：肿瘤细胞核出现棕黄色颗粒为阳性染色，阳性细胞数≥1%判为阳性，阳性细胞数＜1%判为阴性。HER-2判读标准是根据2013 年ASCO/CAP HER-2检测指南：0（阴性）为未观察到着色，+（阴性）为＞10%的肿瘤细胞呈现不完整的、微弱的膜染色，++（可疑阳性）为＞10%的肿瘤细胞呈现不完整的中等强度的膜染色，+++（阳性）为＞10%的肿瘤细胞呈现完整的强的膜染色；HER-2蛋白++的表达还需经过荧光原位杂交（FISH）进一步验证，若扩增则为阳性。Ki-67蛋白阳性表达是根据2011年中国抗癌协会指南制定的标准判断：肿瘤细胞核出现棕黄色颗粒为阳性染色，阳性细胞数≥14%判为高表达，阳性细胞数＜14%判为低表达。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两两比较采用独立样本t检验。计数资料以率表示，采用X2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 外周血淋巴细胞亚群在不同分子亚型乳腺癌和正常者中的表达情况

在166例乳腺癌患者中，Luminal A型为34例（20.5%），Luminal B型为90例（54.2%），HER-2过表达型为30例（18.1%），三阴性型为12例（7.2%）。在Luminal A型、Luminal B型及HER-2过表达型中，CD3+活性、CD4+/CD8+比值均下降，与正常健康组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；在4种分子亚型中，CD4+、CD19+活性均下降，与正常健康组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；NK（CD16+CD56+）活性在三阴性型中下降，与正常健康组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；而4种分子亚型与正常健康组比较，CD8+活性的差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

2.2 不同组织学分级乳腺癌患者外周血淋巴细胞亚群情况的比较

乳腺癌组织学Ⅲ级、Ⅱ级与Ⅰ级比较，CD3+、CD8+、CD4+/CD8+、CD19+的差异均无统计学意义（P＞0.05）；组织学Ⅱ级的CD4+活性明显低于组织学Ⅰ级，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）；组织学Ⅲ级的NK（CD16+CD56+）活性明显低于组织学Ⅱ级，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

2.3 乳腺癌患者外周血淋巴细胞亚群与淋巴结状态分析的比较

有淋巴结转移的患者CD4+活性低于淋巴结无转移的患者，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）；有淋巴结转移的患者CD4+/CD8+比例低于淋巴结无转移的患者，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）；而CD3+、CD8+、NK（CD16+CD56+）、CD19+的活性在淋巴结不同状态中的差异均无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

在正常的情况下，人体免疫系统主要由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成，对机体具有免疫防御和免疫监视的功能。人体的免疫功能平衡一旦被打破，就会引起疾病的发生和发展，许多研究表明免疫功能低下或失调会引起肿瘤的发生发展，同时也会影响患者的治疗效果和预后［5］。随着分子生物学技术手段的提高和普及，临床能更好地找到治疗的有效靶点并预后判断，指导临床个体化治疗。免疫治疗是目前治疗肿瘤的有效手段，而乳腺癌的分子分型是近年来研究的热点，其最终目的都是为了能指导临床个体化治疗［6］。本文通过对不同分子亚型的乳腺癌患者外周血淋巴细胞亚群的研究，目的是了解乳腺癌患者的免疫功能，对临床的免疫治疗、预后判断及疗效评价具有一定的指导意义。

人体抗肿瘤的免疫有细胞免疫和体液免疫，以细胞免疫为主。细胞免疫主要由T细胞、B细胞、NK细胞共同完成。CD3为全部的T细胞，根据功能又可将其分为CD4+和CD8+等亚群，CD4是辅助性T淋巴细胞的表面抗原，CD4+细胞不能直接识别肿瘤细胞，也不能直接杀伤肿瘤细胞，而是把相关的肿瘤抗原提呈给相应的效应细胞，从而特异性地激发活化的细胞发挥抗肿瘤作用。CD8为具有负调节效应的抑制性T淋巴细胞，可引起细胞裂解及介导靶细胞凋亡，从而特异性地直接杀伤肿瘤细胞［7］。CD16+/CD56+是NK细胞的表面抗原，NK细胞是机体重要的抗肿瘤效应细胞，是抗肿瘤的天然屏障，主要是通过分泌各种细胞毒因子直接杀伤靶细胞。CD19+是B系细胞上的表面抗原，也是一种重要的抗肿瘤效应细胞，成熟的B淋巴细胞可进一步分化为浆细胞分泌各类免疫球蛋白，如IgA、IgG、IgM，其可通过体液免疫机制发挥抗肿瘤作用［8］。

国内外许多研究报道指出，在肿瘤患者外周血中可检测到CD8+细胞比例升高，而CD3+、CD4+、CD4+/ CD8+、NK、CD19比例都下降［9-10］。CD4+淋巴细胞能激活效应细胞发挥抗肿瘤作用，CD8+淋巴细胞则主要起负调节的免疫抑制作用，在正常情况下，CD4+/CD8+比值维持在一定的范围内，以保持机体免疫功能稳定［11］，一旦肿瘤形成，肿瘤细胞就会产生免疫抑制因子，抑制淋巴细胞分化增殖，导致CD4+细胞抗原减少，CD8+细胞反应性增多，而增多的抑制性CD8+细胞又反过来抑制CD4+细胞，从而导致CD4+/CD8+值下降甚至倒置。随着肿瘤的进展，产生和分泌的抑制因子会越来越多，诱导CD8产生的同时也阻止CD4细胞的产生［12-13］。本研究结果显示，各个分子亚型的乳腺癌患者外周血的淋巴细胞亚群比例普遍比正常健康人群低，在Luminal型及HER-2过表达型中，外周血CD3+比对照组显著降低，各分子亚型乳腺癌的CD4+和CD19+普遍比正常健康组降低，差异有统计学意义，研究结果与相关文献基本一致［14］。三阴性型的NK细胞比例与正常健康组比较显著降低，差异有统计学意义，提示三阴性型乳腺癌侵袭性较强，发展较快，预后较差。在本研究中笔者还发现HER-2过表达型的CD3、CD4比例比其他亚型的乳腺癌都低，提示HER-2过表达型的乳腺癌可能进展较快，预后不良。乳腺癌分子亚型外周血中CD8+T淋巴细胞比例与正常健康组无显著性差异，分析原因可能是与肿瘤的进展无明显相关，也可能与本研究采集的样本量不够大有关。

乳腺癌患者体内存在免疫功能异常，是否与肿瘤的组织学分级和淋巴结状体相关？有研究显示，有淋巴结转移的患者细胞免疫明显受到抑制，随着疾病的进展，机体免疫功能逐渐降低［14］。同样有文献指出乳腺癌组织学分级与总生存率密切相关，组织学分级越高，5年和10年存活率则越低［15］。本研究发现，组织学Ⅱ级的CD4+比Ⅰ级的低，差异有统计学意义；组织学Ⅲ级的NK细胞要比Ⅱ级的显著降低，差异有统计学意义，由此可推断随着疾病的进展，外周血的淋巴细胞比值差异会越来越明显，免疫功能会遭受严重破坏。但各组织学分级的CD3、CD8、CD19无显著差异，可能与本研究的样本量不够多有关。据文献报道乳腺癌淋巴结是否转移是判断乳腺癌患者预后的重要指标，总生存率随着淋巴结转移数目的增多而下降［16］。在本研究中笔者发现有淋巴结转移的患者CD4+活性及CD4+/CD8+比值低于淋巴结无转移的患者，两者比较差异均有统计学意义，这提示有淋巴结转移的患者免疫功能较低下，预后不良。

综上所述，本研究进一步证实了乳腺癌患者存在免疫功能低下或失调，检测不同分子亚型乳腺癌患者外周血淋巴细胞亚群水平，能客观地反映患者机体的细胞免疫功能状态，对判断乳腺癌患者预后、分析肿瘤的发展情况、判断疗效具有一定的参考价值。

［1］Redig AJ，McAllister SS.Breast cancer as a systemic disease：a view of metastasis［J］.J Intern Med，2013，274（2）：113-126.

［2］Siegel R，Ma J，Zou Z，et al.Cancer statistics［J］.CA，2014， 64（1）：9-29.

［3］Wang CH，Li JZ，Zhang W.Breast cancer molecular subtypes of Uygur and Han in Xinjiang of China［J］.Int J Clin Exp Med，2014，7（4）：1116-1121.

［4］Perou CM，Sorlie T，Eisen MB，et al.Molecular portraits of human breast tumours［J］.Nature，2000，406（6797）：747-752.

［5］Hochest B，Diehl L.Antigen shedding into the circulation contributes to tumor immune escape［J］.Oncoimmunology，2012，1（9）：1620-1622.

［6］秦颖，张同先，张巍，等.青年乳腺癌临床病理特点分子分型及预后分析［J］.中国肿瘤临床，2014，41（4）：231-236.

［7］Witte E，Witte K，Warszawska K，et al.Interleukin -22：a cytokine produced by T，NK and NKT cell subsets，with importance in the innate immune defense and tissue protection［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2010，21（5）：365-379.

［8］张铁英，康丽花，刘远航，等.不同分子亚型乳腺癌T淋巴细胞和NK细胞检测的临床意义［J］.中国妇幼保健，2015，30（21）：3594-3595.

［9］Rad FR，Ajdary S，Omranipour R，et al.Comparative analysis of CD4+and CD8+T cells in tumor tissues，lymph nodes and the peripheral blood from patients with breast cancer［J］. Iran Biomed J，2015，19（1）：35.

［10］冀为，周岩，牛瑞芳.外周血T淋巴细胞亚群与不同分子分型乳腺癌患者无病生存的相关性研究［J］.中国肿瘤临床，2014，41（21）：1363-1367.

［11］Tabariès S，Ouellet V，Hsu BE，et al.Granulocytic immune infiltrates are essential for the efficient formation of breast cancer liver metastases［J］.Breast Cancer Res，2015，17（1）：1-18.

［12］孙林，温江涛，刘海红.乳腺癌患者外周血T淋巴细胞及NK细胞的检测及其临床意义［J］.现代肿瘤医学，2006，14（9）：1069-1071.

［13］林志明，刘慧，高全立，等.乳腺癌患者外周血中调节性T细胞的表达及意义［J］.现代预防医学，2011，38（12）：2258-2260.

［14］李永峰，吴云飞，张慧.淋巴结转移比率在预测淋巴结转移乳腺癌患者预后中的价值［J］.中国普外基础与临床杂志，2011，18（7）：750-754.

［15］朱赤红，许沈华，凌雨田.乳腺癌外周血淋巴细胞亚群检测及其预后意义［J］.中国卫生检验杂志，2013，23（14）：2957-2960.

［16］韦录，吴向华，刘金录，等.乳腺癌复发转移的相关分子生物学指标临床意义的研究［J］.广西医科大学学报，2012，29（2）：237-239.

Significance of lymPhocyte subsets and molecular subtyPes of breast cancer and clinical Pathological characteristics

WEI Chang-hong1NING Shu-fang2WEI Wen-e2LI Ji-lin2LIU Hai-zhou2CHEN Yi2ZHANG Li-tu2▲
1.Department of Pathology，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；2.Department of Research，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China

［Abstract］Objective To detect the changes of peripheral blood lymphocyte subsets in patients with different subtypes of breast cancer，and explore the relationship between different subtypes of breast cancer and their clinical pathological characteristics. Methods A total of 206 patients with women breast disease were selected from January to December 2013 in Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University，and were randomly divided into for 166 cases of patients with breast cancer group（observation group，n = 166）and 40 cases of healthy people as normal healthy group （control group，n = 40）.Immunohistochemistry envision two-step was used to detect the expression of estrogen receptor （ER），progesterone receptor（PR），human epidermal growth factor receptor-2（HER-2）and Ki-67，using flowcytometry to detect the two group the of peripheral blood lymphocyte subgroup of CD3+，CD4+，CD8+，CD16+CD56+，CD19+activity，combined with the clinical and pathological features were analyzed and compared. Results Compared with the normal healthy group，the percentage of CD3+and CD4+/CD8+was significantly decreased in the groups of Luminal A，Luminal B type and HER-2 over expression（P＜0.05）.In the four kinds of molecular subtypes，the activity of CD4+and CD19+was significantly decreased compared with the normal healthy group（P＜0.05）.The activity of NK（CD16+CD56+）of triple negative was significantly decreased compared with the normal healthy group（P＜0.05）；Histological gradeⅡhad a significantly lower activity of CD4+than the group of histology gradeⅠ（34.35±9.03 vs 38.12±8.75，P＜0.05）.The histological gradeⅢhad a significantly lower activity of NK（CD16+CD56+）than the histological gradeⅡ（13.92±6.34 vs （16.15±7.98，P＜0.05）.The activity of CD4+and CD4+/CD8+ratio in patients with lymph node metastasis were significantly lower than the patients without lymph node metastasis（P＜0.05）. Conclusion The determination of peripheral blood lymphocyte subsets in patients with different molecular subtypes of breast cancer patients has a certain significance in the state of immune function，which can contribute to the observation of the disease，curative effect monitoring and prognosis.

［Key words］Breast cancer；Lymphocyte subsets；Molecular subtype；Clinicopathology characteristics

［中图分类号］R737.9

［文献标识码］A

［文章编号］1674-4721（2016）04（b）-0008-04

［基金项目］广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻1298003-2-8；桂科攻1355005-3-10）

收稿日期：（2016-01-11 本文编辑：卫轲）