姚伟城1江 琼1胡诚亮1徐君平1谢 青1沈辉帆1何嘉慧1井永斌2赵炜疆1▲1.汕头大学医学院神经科学中心，广东汕头 515041；2.哈尔滨医科大学附属第二医院骨外科，哈尔滨 150001

［摘要］目的研究神经调节蛋白-1（Nrg1）对脊髓损伤修复相关分子表达的影响并初步探讨其分子机制。方法将12只3个月龄C57BL/6雌性小鼠随机分成对照组和Nrg1给药组，每组6只，经过压迫性脊髓损伤后，通过鼠尾静脉注射分别连续给予DMSO溶剂和重组Nrg1β（rNrg1β）7 d，正常饲养6周后取其损伤部位脊髓样本进行蛋白免疫印迹（Western blot）检测Nrg1受体及相关分子蛋白的表达，比较两组间差异。结果与对照组比较，Nrg1给药组Nrg1受体ErbB4和Neu的磷酸化水平有所升高，其中ErbB4磷酸化水平显著升高（P＜0.01）；Nrg1给药组神经再生相关分子mTOR和Bcl-2表达显著升高（P＜0.05），而不利于损伤后修复的分子PTEN、GFAP和Bax的表达下降。结论通过外源性给予Nrg1激活其受体ErbB4和Neu，可升高小鼠脊髓损伤后神经再生相关分子mTOR磷酸化激活和Bcl-2蛋白水平，下调抑制脊髓损伤后修复相关分子PTEN、GFAP和Bax蛋白水平，这些作用可能是通过激活Erk信号通路实现的。

［关键词］神经调节因子-1；脊髓损伤；修复；分子机制

▲通讯作者：赵炜疆（1975-），男，首都医科大学神经生物学博士，美国加州大学洛杉矶分校Cedars-Sinai医学中心博士后，研究员，汕头大学医学院神经生物学专业硕士生导师，研究方向：脊髓损伤、神经内分泌及神经系统退行性疾病

脊髓损伤是严重的中枢神经系统创伤性疾病，在全球呈现出高发生率、高致残率、高耗费和低龄化的“三高一低”局面，是亟待解决的重大医学难题。目前，由于缺乏有效的修复机制并受到大量抑制分子的影响，成年哺乳动物的脊髓在损伤后无法恢复，从而导致严重的运动功能障碍和难以忍受的疼痛。当前药物疗法的作用非常有限，尚不能很好地促进患者脊髓损伤后的自行恢复。脊髓损伤的治疗手段十分有限，尚无突破性进展，且临床治疗中仍以骨折复位固定为主，药物治疗中以大剂量甲基强地松龙（MP）应用较多。然而，近年来大剂量MP应用引起的感染及消化道出血等潜在风险也逐渐引起了人们的关注［1］。因此，针对脊髓损伤的治疗策略亟需深入的研究。

神经调节蛋白（neuregulin，Nrg）家族是一类调节生长和分化的多肽类神经生长因子，属于表皮生长因子超家族成员。Nrg家族蛋白都含有相似的结构域，包括免疫球蛋白样环状结构、表皮生长因子（EGF）样结构域、跨膜区和长短不一的胞内结构域。Nrg1是神经调节蛋白家族的成员之一［2-3］，主要由神经元和神经胶质细胞分泌［4-5］。Nrg1的EGF样结构域与受体ErbB蛋白结合并激活ErbB受体的酪氨酸激酶活性，从而触发下游信号通路，激活一系列细胞内生物学级联反应［6-8］，包括刺激神经干细胞分化、神经元迁移、轴突再生以及突触形成［9-10］。已有研究表明，在哺乳动物神经系统中Nrg1表达主要以Nrg1β为主，其β型EGF样结构域与ErbB4受体结合调控神经元生长、存活和代谢［11］。本研究通过小鼠脊髓损伤后经尾静脉注射外源性Nrg1β，利用蛋白免疫印迹（Western blot）检测促进神经再生相关分子mTOR和Bcl-2，以及不利于损伤后修复的分子PTEN、GFAP和Bax表达的变化，在蛋白水平上探讨Nrg1对小鼠脊髓损伤后修复的影响。

1.1 实验动物

健康野生型3个月龄SPF级雌性C57BL/6小鼠12只，购自广东省医学实验动物中心，体质量19～23 g，平均20 g，动物质量合格证号为SCXK（粤）2008-0002。实验动物饲养于汕头大学医学院实验动物中心，室内环境恒定温度25℃，每12小时黑暗/光照循环交替，动物自由摄食、饮水。所用动物实验操作均遵循汕头大学医学院动物伦理委员会的相关规定，尽量减少实验动物的痛苦并最大限度地减少实验动物的用量。

1.2 主要仪器与试剂

外源性重组Nrg1β（rNrg1β，CYT-407，ProSpec-Tany TechnoGene公司，以色列）溶解在0.1%的DMSO （MP Biomedicals公司，法国）中，并用生理盐水稀释至2.5 nmol/L。兔抗pErbB4（1∶500，sc-33040），兔抗ErbB4（1∶1000，sc-283），兔抗pNeu（1∶500，sc-12352-R），小鼠抗Neu（1∶1000，sc-33684），小鼠抗pErk1/2 （1∶1000，sc-7383），小鼠抗Erk1/2（1∶1000，sc-135900），小鼠抗pAkt1（1∶1000，sc-81433），小鼠抗Akt1（1∶1000，sc-55523），兔抗Bax（1∶1000，sc-526），小鼠抗Bcl-2（1∶1000，sc-7382），兔抗mTOR（1∶500，sc-8319），兔抗pmTOR（1∶500，sc-101738），小鼠抗PTEN（1∶1000，sc-7974），以及小鼠抗β-actin抗体（1∶1000，sc-47778）均购自美国Santa Cruz公司。兔抗GFAP抗体（1∶1000，BA0056）购自武汉博士德生物公司。

1.3 小鼠脊髓损伤动物模型的制备

将3个月龄野生型C57BL/6雌性小鼠随机分成对照组和Nrg1给药组，每组6只，通过腹腔注射麻醉剂（氯胺酮100 mg/kg；甲苯噻嗪5 mg/kg）使其深度麻醉，剔去背部毛发，将小鼠俯卧位固定于手术台上，75%乙醇消毒，行背中段正中切口，以T8为中心，长约2 cm依次切开皮肤，皮下组织，锐性切开椎旁肌并向两侧分离，暴露T8～L1椎体棘突及椎板，纹式钳小心咬除T9～T11棘突及全椎板。以T10为中心（定位：通过计数肋骨发现小鼠椎体棘突特点为T9棘突斜向尾侧，T11斜向头侧，T10中立）用镊子100%完全压迫脊髓5 s，造成脊髓损伤，致伤瞬间，小鼠痉挛性摆尾，双下肢及躯体回缩扑动后双下肢瘫痪，此为造模成功标志。然后止血，盐水冲洗，以0号线逐层缝合。术毕在创口撒少许青霉素粉，以防感染。稍后腹腔注射生理盐水200 μl，30 min后待小鼠逐渐清醒，每天同一时间点通过鼠尾静脉注射200 μl 2.5 nmol/L的Nrg1β，连续给药7 d，分笼饲养，且每天进行2次人工挤压膀胱排尿，6周后取材进行实验。

1.4 Western blot实验

于脊髓损伤后6周，取损伤区中央上下游0.25 cm（总长0.5 cm）部分脊髓为新鲜组织样本，立即干冰保存。使用组织裂解液并通过匀浆器裂解组织，提取蛋白质，按4∶1体积比与上样缓冲液混合，95℃变性10 min，加样，积层胶（5%，质量分数）中恒压80 V电泳，进入分离胶（10%，质量分数）后改恒压120 V，之后湿转，恒流300 mA转膜3 h，以质量分数5%的TBST脱脂奶粉或BSA缓冲液室温封闭1 h，之后使用不同浓度一抗与PVDF膜孵育，4℃振荡孵育过夜后用HRP标记的相应二抗（1∶1000）室温孵育1 h。每次孵育结束后以TBST洗膜3次，每次5 min。用ECL超敏发光法检测蛋白质表达，凝胶图像分析仪采集化学发光信号。为探讨Nrg1介导小鼠脊髓损伤修复的分子机制，本研究选取Nrg1-ErbB信号转导的下游通路中MAPK-Erk和PI3K-Akt两条信号通路展开，同时检测激活型Akt1（pAkt1）和激活型Erk1/2（pErk1/2）的蛋白水平变化。

1.5 统计学分析

采用Imag J软件测量信号条带灰阶值，并利用统计软件SPSS 18.0对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用X2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 Nrg1受体ErbB4、Neu在脊髓损伤中央区的表达及其磷酸化水平变化

Western blot检测对照组和Nrg1给药组的ErbB4 和Neu磷酸化蛋白水平变化，结果6周后，与对照组比较Nrg1对小鼠损伤脊髓中的Nrg1受体原型无明显影响，但两受体的磷酸化蛋白水平较对照组均呈现增高趋势，其中Nrg1可显著增高ErbB4蛋白磷酸化水平（P＜0.01）（图1），提示Nrg1可磷酸化脊髓内相应受体，增高其活性。

2.2 Bcl-2、mTOR的蛋白及其磷酸化水平变化

Western blot检测Bcl-2和pmTOR的蛋白水平变化情况，结果与对照组比较，Nrg1给药组可显著上调Bcl-2和pmTOR蛋白水平（P＜0.05）（图2），提示Nrg1可促进神经再生相关分子mTOR和Bcl-2的表达水平升高。

2.3 PTEN、GFAP和Bax在脊髓损伤中央区蛋白的表达水平变化

Western blot检测结果显示，与对照组比较，Nrg1抑制肿瘤细胞标志物PTEN蛋白的表达（图3A），同时对星形胶质细胞标志物GFAP的蛋白表达（图3B）和促凋亡蛋白Bax的表达水平（图3C）也有一定的下调作用。

2.4 Akt和Erk在脊髓损伤中央区的蛋白表达水平变化

Western blot实验结果显示，与对照组比较，rNrg1 对Akt分子以及pAkt的蛋白水平影响不明显（图4A），而给予Nrg1可略微下调Erk1/2的蛋白表达，同时增加Erk1/2蛋白的磷酸化水平（图4B）。

Nrg1通过结合并激活其受体ErbBs二聚体，活化下游信号通路分子，如ERK和PI3K等，进而参与一系列的细胞内信号转导过程［12］，且Nrg1-ErbB信号通路的激活在神经发育和细胞的增殖分化等生命过程中发挥重要作用［13-14］。脊髓损伤后，损伤部位会产生胶质瘢痕甚至形成空洞、囊性变等病理变化，导致修复过程中神经纤维很难穿越胶质瘢痕区域。同时脊髓损伤也会引起大量神经元轴突的损伤，甚至神经元死亡，最终损伤区近端不能与脊髓远端建立信号联系［15］。本研究中，通过给予外源性Nrg1β治疗小鼠脊髓损伤，结果ErbB4、Neu的磷酸化水平显著高于对照组，表明通过给予rNrg1可激活损伤脊髓中Nrg1-ErbB信号通路。但是，Nrg1-ErbB信号通路的激活是否会参与到脊髓损伤修复的调控过程？根据脊髓损伤后病理生理特性以及已知Nrg1-ErbB信号通路的功能，本研究对给予Nrg1后神经再生相关分子Bcl-2、mTOR和脊髓损伤修复抑制分子PTEN、GFAP和Bax的蛋白水平变化进行了初步研究。检测结果显示，Nrg1给药组Bcl-2和mTOR的表达较对照组显著升高，同时，PTEN、GFAP和Bax的分子表达水平较对照组显著下降，上述结果提示给予rNrg1对脊髓损伤再生相关分子的蛋白表达有调控作用。在本研究中，笔者在蛋白水平上总体量化相关分子的表达变化，但并未对这些分子在脊髓损伤后的表达和分布做进一步的形态学研究。因此，未来笔者将采用免疫荧光双标染色技术来进一步探究Nrg1调控的这些分子在脊髓损伤后分子表达的细胞类型和分布区域，从而在亚细胞水平找到相应的蛋白共定位证据。在神经系统的发育中，Akt1是神经元存活的关键分子，Akt1的磷酸化会使凋亡途径失活，而细胞外调节蛋白激酶Erk1/2是将信号从表面受体传导至细胞核的关键。研究表明Nrg1与其受体ErbB结合可启动Erk等激酶信号转导途径［12］，参与神经元的存活和神经突起的生长［16］。在本研究结果中，Nrg1给药组Akt1的蛋白磷酸化水平较对照组无显著差异，而Erk1/2的蛋白磷酸化水平较对照组有升高趋势，提示Nrg1激活Nrg1-ErbB信号通路后上调有益于神经元修复相关分子，下调脊髓损伤修复抑制分子的蛋白水平表达，可能主要通过Erk信号通路实现的，对Akt信号通路的影响不明显。Nrg1在脊髓损伤治疗中的效果，尤其是对行为学改善的影响，有待通过动物模型实验进一步求证。

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Research of neuregulin-1（Nrg1）for Promoting rePair after sPinal cord injury via activating Nrg1-ErbB recePtor signaling transduction in mice

YAO Wei-cheng1JIANG Qiong1HU Cheng-liang1XU Jun-ping1XIE Qing1SHEN Hui-fan1HE Jia-hui1JING Yong-bin2ZHAO Wei-jiang1▲
1.Center for Neuroscience，Medical College of Shantou University，Guangdong Province，Shantou 515041，China；2.Department of Orthopedic Surgery，the Second Hospital Affiliated to Harbin Medical University，Heilongjiang Province，Harbin 150001，China

［Abstract］Objective To study the effects of Neuregulin-1（Nrg1）on the expression of molecules associated with repair of spinal cord injury in mice and to preliminarily explore the related molecular mechanism. Methods Twelve 3-month-old C57BL/6 female mice were evenly divided into control group and Nrg1 group，and each group contained 6 mice.Mice were administrated with either DMSO solvent or Nrg1β diluted in DMSO by tail vein injection for 7 consecutive days after spinal cord injury.Tissues within the injury site were collected for performing western blot to measure the expression level of the molecules involved after 6 weeks of routine feeding.The differences between two groups were compared. Results Compared with the control group，the phosphorylation levels of Nrg1 receptors ErbB4 and Neu were significantly elevated in the Nrg1 group（P＜0.01）.The protein levels of pmTOR and Bcl-2 were also significantly increased by Nrg1 when compared with the control group（P＜0.05）and the levels of PTEN，GFAP and Bax were apparently decreased in the Nrg1 group. Conclusion The phosphorylation levels of Nrg1 receptors ErbB4 and Neu can be increased by exogenous Nrg1.The protein levels of regeneration-promoting molecules after spinal cord injury，including pmTOR and Bcl-2，are elevated，whereas those of the regeneration-inhibiting molecules，including PTEN，GFAP and Bax，are reduced by exogenous Nrg1.These effects may be achievedbytheactivationof Erk1/2signalingpathways.

［Key words］Neuregulin1；Spinalcordinjury；Repair；Molecularmechanism

［中图分类号］R363

［文献标识码］A

［文章编号］1674-4721（2016）04（b）-0004-04

［基金项目］国家自然科学基金资助项目（81171138，81471279）；汕头大学（医学院）创新强校工程人才培养项目（2501220118）

收稿日期：（2016-01-14 本文编辑：卫轲）