细菌感染刺激在狼疮性肾炎进展中的作用研究
栾军军 邢广群▲ 李 远
青岛大学附属医院肾病科，青岛 266555
［摘要］目的 探讨细菌感染刺激在狼疮性肾炎（LN）进展中的作用。 方法 选取2012年12月～2014年12月青岛大学附属医院黄岛院区肾病科没有细菌感染的LN患者19例，根据疾病活动程度分为LN发作期组10例，LN缓解期组9例。另选择青岛大学附属医院查体中心的健康人10例作为健康对照组。提取并培养各组外周血单个核细胞并用CpG-ODN刺激，用ELISA检测血清及细胞上清液中的干扰素-α（IFN-α）水平。 结果 ①LN发作期患者血清IFN-α的水平［（1072.87±530.99）ng/ml］明显高于LN缓解期患者［（348.60±190.63）ng/ml，P＜0.01］以及健康对照组［（293.31±214.40）ng/ml，P＜0.01］。②在CpG-ODN的刺激下LN缓解期患者外周血单个核细胞上清液IFN-α水平［（2616.36±2393.76）ng/ml］明显高于 LN发作期患者［（1109.37±396.66）ng/ml，P=0.024］以及健康对照组［（1121.98±370.46）ng/ml，P=0.025］。 结论 细菌感染是LN疾病加重的诱发因素。
［关键词］狼疮性肾炎；细菌DNA；干扰素-α；外周血单个核细胞
系统性红斑狼疮 （systemic lupus erythematosus，SLE）是一种累及多个器官的自身免疫性疾病，50%以上的患者有肾脏受累的表现，狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是SLE较常见且严重的并发症［1］。最近有研究显示在SLE的免疫发病机制中，天然免疫系统的功能异常也起着极为重要的作用［2］。在感染和炎症时，中性粒细胞能够释放活性介质、吞噬抗体或补体结合的病原体，在天然免疫中发挥关键作用［3］。Garcia-Romo等［4］发现中性粒细胞胞外罗网（neutrophil extracellular traps，NETs）参与了SLE及LN的发生及发展。NETs是中性粒细胞的另一种杀菌形式［5］，研究表明SLE患者体内的NETs中含有自身DNA和抗菌肽，能够被Toll样受体-9（TLR-9）识别，活化浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）［6］。而细菌的基因组中含有去甲基化胞嘧啶-磷酸鸟嘌呤（CpG）DNA回文重复序列［7-8］，人工合成的胞嘧啶-磷酸盐-鸟嘌呤基序寡脱氧核苷酸（CpG-ODN）与细菌DNA具有相似的免疫作用，都能通过TLR-9激活pDCs，释放白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-8 （interleukin-8，IL-8）、干扰素（interferon，IFN）等，这些因子都有助于激活机体的免疫B淋巴细胞产生抗体，导致自身免疫性疾病的发生［9］。也有研究表明，IL-1、IL-6、IL-10以及肿瘤坏死因子等也促进SLE的发生［10］。更有研究表明，B淋巴细胞能够通过对CpG-ODN的应答参与SLE的进展及活动［11］。可见感染与自身免疫之间存在一定的关系，但是这种潜在的机制仍然尚未明确。本研究通过检测LN各期INF-α的水平及CpG-ODN刺激后INF-α的变化，旨在探讨细菌感染刺激在LN疾病进展中的作用。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选取2012年12月～2014年12月青岛大学附属医院黄岛院区肾病科LN患者19例，根据疾病活动程度分为LN发作期组10例，其中男性3例，女性7例，平均年龄（25.50±8.55）岁；LN缓解期组9例，其中男性3例，女性6例，平均年龄（26.89±10.19）岁。选取同期青岛大学附属医院查体中心的健康人10例作为健康对照组，其中男性2例，女性8例，平均年龄（36.4± 14.83）岁。各组年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。
1.2 LN的诊断标准
依据美国风湿病学会1997年修订的SLE分类标准，先后或同时符合四项或四项以上者可诊断为SLE［8］。在确诊SLE的基础上有肾脏受累的表现，如持续性的蛋白尿（＞0.5 g/d，或＞+++）或管型（可以为红细胞、血红蛋白的颗粒、管状或混合型），并排除肾小球肾炎及其他自身免疫性疾病等［9］。LN的活动性指数应用SLE疾病活动性指数（SLEDAI）评分，本研究中LN患者发作期组SLEDAI评分＞4分，LN患者缓解期组SLEDAI评分≤4分。
1.3 方法
①血清学特点：检测所有患者的C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、血红蛋白（hemoglobin，Hb）、血小板计数（platelet，PLT）、血清肌酐（creatinine，Cr）、血清补体C3、尿红细胞计数（urine red blood cell count，URBC）、尿白细胞计数 （urine white blood cell count，UWBC）、24 h尿蛋白定量等临床指标。②IFN-α：收集各组人群新鲜外周血2 ml，4℃条件下1000×g离心20 min，取上清，储存于-80℃冰箱备用，用ELISA试剂盒检测血清的IFN-α浓度。③外周血单个核细胞的分离，刺激与培养：收集各组人群肝素化的新鲜全血20 ml，用PBS 液1∶1稀释液，上层加入淋巴细胞分离液后，室温下600×g离心20 min。用一次性吸管吸取中间的云雾膜层（主要为单个核细胞），置于新的离心管中加5倍体积以上RPMI16401000×g离心10min，弃上清，再5倍体积以上RPMI 1640 1000×g离心10 min，弃上清，将下层沉淀转移至细胞培养皿中，加适量细胞培养液并加IL-2（浓度为10 ng/ml）。将沉淀与细胞培养液混匀，平均分成2份，分别转移于新培养皿中。第1份不用任何物质刺激；第2份用CpG-ODN（浓度为3.2 mg/ml）刺激，培养7 d后收集上清液，离心，取上清，储存于-80℃冰箱备用，用ELISA试剂盒检测上清液的IFN-α浓度。IFN-α浓度的检测步骤严格按照说明书执行。④用多功能酶标仪于450 nm波长处检测OD值，以吸光度OD值为纵坐标，相应的IFN-α标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，可根据标准曲线换算出相应的浓度，再乘以稀释倍数，即为实际的IFN-α浓度。
1.4 统计学分析
采用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（.jpg)
±s）表示，根据是否符合正态分布及方差齐性，多组间的比较采用单因素方差分析或Krusual-Wallis H检验，其中Krusual-Wallis H检验后的两两比较检验标准为校正后的α值，以P＜0.05为差异有统计学意义。
±s）表示，根据是否符合正态分布及方差齐性，多组间的比较采用单因素方差分析或Krusual-Wallis H检验，其中Krusual-Wallis H检验后的两两比较检验标准为校正后的α值，以P＜0.05为差异有统计学意义。2 结果
2.1 LN患者的临床及血清学特点
LN发作期患者的ESR和24 h尿蛋白定量明显高于LN缓解期患者，差异有统计学意义（P＜0.05），CRP、Cr、URBC及UWBC也高于LN缓解期患者，但差异无统计意义 （P＞0.05）；LN发作期患者PLT和血清补体C3明显低于LN缓解期患者，差异有统计学意义（P＜0.05），LN发作期患者Hb水平也低于LN缓解期患者，但差异无统计意义（P＞0.05）（表1）。
表1 LN患者临床及血清学特点（.jpg)
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2.2 各组血清IFN-α水平的比较
健康对照组血清中IFN-α的水平为（293.31± 214.40）ng/ml，而LN缓解期患者血清IFN-α的水平为（348.60±190.63）ng/ml，LN发作期患者血清IFN-α的水平为（1072.87±530.99）ng/ml，LN发作期患者血清IFN-α的水平明显高于LN缓解期患者及健康对照组（均P＜0.01）（图1）。
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图1 各组血清IFN-α水平的比较
2.3 CpG-ODN刺激各组外周血单个核细胞7 d后细胞上清液IFN-α水平的比较
在CpG-ODN的刺激下LN发作期患者外周血单个核细胞上清液IFN-α水平为（1109.37±396.66）ng/ml，LN缓解期患者IFN-α水平为（2616.36±2393.76）ng/ml，健康对照组外周血单个核细胞上清液IFN-α水平为（1121.98±370.46）ng/ml，LN缓解期患者外周血单个核细胞上清液IFN-α水平明显高于LN发作期患者（P=0.024）及健康对照组（P=0.025）（图2）。
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图2 CpG-ODN刺激各组外周血单个核细胞7 d后细胞上清液IFN-α水平的比较
3 讨论
SLE及LN的病因及发病机制尚未完全明确，涉及多种因素，认为遗传、环境以及雌激素等因素相互作用，引起自身免疫调节功能的紊乱终致疾病的发生。目前有研究显示固有免疫参与SLE和LN的发生。近年来，有研究表明SLE患者体内的大量免疫复合物及细胞因子可激活中性粒细胞，释放大量NETs［14］。也有研究表明SLE及LN的发生与IFN-α为代表的固有免疫的过度激活有关［15］。在SLE患者中pDCs受病毒感染及环境因素的诱导下分泌IFN-α进而诱导自身抗体的产生，并与凋亡细胞的DNA组成复合物，打破免疫耐受并促进自身免疫的应答［16］。本研究中笔者发现LN发作期患者血清IFN-α的水平明显高于LN缓解期患者以及健康对照组，提示IFN-α可能参与了SLE 及LN的发生，IFN-α的水平与疾病的活动度有关。
大量研究已证实，细菌的CpG-DNA可以激活机体多种免疫细胞，并产生多种细胞因子，尤其是可以调节免疫应答向Th型的转化；人工合成的CpG-ODN可完全模拟上述反应［17-18］，并且去甲基化的CpG能够提高免疫应答［19］。富含CpG-ODN的狼疮免疫复合物激活浆细胞样的树突细胞，在溶酶体内与TLR-9结合，TLR-9识别配体并诱发一系列信号级联反应，导致pDCs激活进而产生大量细胞因子如IFN-α和趋化因子，参与 SLE的疾病过程［20］。本研究发现在CpG-ODN的刺激下LN缓解期患者外周血单个核细胞上清液IFN-α升高幅度明显高于健康对照组，提示LN患者的淋巴细胞已处于与正常人群不同水平的反应状态，尽管是缓解期，但若受到细菌DNA的刺激后则立即分泌IFN-α，即LN患者在缓解期如受到细菌感染会再次复发，严重者可致疾病暴发。LN发作期患者外周血单个核细胞在受到CpG-ODN的诱导刺激后上清液中IFN-α水平升高反而不明显的原因，可能为此时LN患者的淋巴细胞如IFN-α多数已释放参与过疾病发作，但在发作期，感染仍可诱发LN更加严重，如继发血栓性微血管病等，这值得进一步研究。
综上所述，在细菌感染时细菌DNA能够通过TLR-9激活pDCs，导致IFN-α的释放，可见细菌感染确实是LN疾病加重的诱发因素。
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Effect of bacterial infection stimulation on progression of lupus nephritis
LUAN Jun-jun XING Guang-qun▲ LI Yuan
Department of Nephrology，Affiliated Hospital of Qingdao University，Shandong Province，Qingdao 266555，China
Department of Nephrology，Affiliated Hospital of Qingdao University，Shandong Province，Qingdao 266555，China
［Abstract］Objective To discuss the effect of bacterial infection stimulation on progression of lupus nephritis.Methods 19 LN patients without bacterial infection treated in our department from December 2012 to December 2014 were selected and divided based on the active levels of disease into the LN onset group （n=10）and the LN remission group （n=9）.Another 10 healthy volunteers were selected as the control group.Peripheral blood mononuclear cells（PBMC）were extracted，cultivated and stimulated with CpG-ODN.The level of interferon-α （IFN-α）in serum and supernatant liquid was tested by ELISA.Results①The level of IFN-α was significantly higher in the LN onset group［（1072.87± 530.99）ng/ml］than in the LN remission group［（348.60±190.63）ng/ml，P＜0.01］and the control group［（293.31±214.40）ng/ml，P＜0.01］）.②With the stimulation of CpG-ODN，the PBMC supernatant liquid IFN-α level was significantly higher in the LN remission group［（2616.36±2393.76）ng/ml］than in the LN onset group［（1109.37±396.66）ng/ml，P=0.024］and the control group［（1121.98±370.46）ng/ml，P=0.025］.Conclusion Bacterial infection is an inducing factor of progression of LN.
［Key words］Lupus nephritis；Bacterial DNA；Interferon-α；Peripheral blood mononuclear cell
［中图分类号］R593.2［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）04（a）-0071-04
（收稿日期：2016-01-03本文编辑：卫 轲）
［基金项目］山东省医药卫生科技发展计划项目（2014WS 0176）；山东省青岛市民生科技计划项目（15-9-2-90-nsh）▲
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