GC-ECD测定当归等10种药食两用中药材中有机氯残留量
何清彦1，2 皮胜玲1，3，4 谢嘉驰1，3，4 夏伯候1，3，4 李亚梅1，3，4▲ 林丽美1，3，4
1.湖南中医药大学药学院，长沙 410208；2.湖南省娄底市食品药品监督管理局娄星分局，湖南娄底 417000；3.湘产大宗药材品质评价湖南省重点实验室，长沙 410208；4.湖南省中药不良成分快速检测及脱除工程技术研究中心，长沙 410208
［摘要］目的 考察当归等10种药食两用中药材中有机氯六六六、滴滴涕和五氯硝基苯的残留量，为该类药食两用药材的安全性评价提供实验数据，为其标准的进一步完善提供参考。 方法 从市场收集该类药材30批次，采用GC-ECD检测方法对其进行9种有机氯农药残留检测。 结果 所建立的含测方法平均回收率为90.97%～103.56%，RSD值0.4%～2.7%。所测定的当归、党参等药材中均含有不同程度的有机氯农药残留。 结论 药食两用药材的农药残留限量需严格控制。
［关键词］药食两用中药材；有机氯残留；气相色谱-电子捕获检测器
随着中药产业的迅速发展，野生药材资源不断减少，现不少药材已到濒危绝境，因此人工栽培成为解决中药资源短缺的主要方式［1-2］。然而，由于生态环境的恶化，病虫的危害，化肥、农药的不合理使用，硫磺熏蒸等不规范生产、加工方式，中药材品质低劣，农药残留、重金属、二氧化硫、硝酸盐等有毒有害物质超标，严重危害患者用药安全，中药材的安全性和质量成为全社会关注焦点和中药材生产加工亟待解决的问题［3-6］。
我国在20世纪70年代末已宣布禁止使用滴滴涕（DDT）、六六六（BHC）等有机氯农药［7-8］，因此类农药化学性质稳定，脂溶性大，残留期长，易在脂肪组织中蓄积，造成慢性中毒，危及人体健康。然而，目前有机氯农药残留污染仍是造成中药材质量下降的主要原因之一，且已成为制约我国中药材走向国际市场的重要障碍［9-16］。鉴于药食两用药材是一类使用频率最高、用量大、理论上安全保障最好的中药材，更是人们日常生活食疗保健的原料，笔者收集了市场上10种药食两用药材，包括当归、党参、天麻、黄芪、甘草、玉竹、百合、金银花、山银花、菊花，共30批次，采用GCECD法测定其中9种有机氯农药残留的含量，考察其中有机氯BHC、DDT和五氯硝基苯（PCNB）的残留量，为该类药食两用药材的安全性评价提供实验数据，且为其标准的进一步完善提供参考。
1 仪器与试药
1.1 仪器
GC-2010 Plus气相色谱仪，包括63Ni电子捕获检测器，自动进样器，LCsolution工作站（日本岛津）；KQ3200B型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；800B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；氮吹仪；刻度浓缩瓶。
1.2 试药
BHC（α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC）、DDT （p，p′-DDE、p，p′-DDD、o，p′-DDT、p，p′-DDT）、PCNB农药标准品均购自农业部环境保护科研监测所（浓度均为100 μg/ml，纯度＞97.7%），当归、党参、天麻、黄芪、甘草、玉竹、百合、金银花、山银花、菊花各3批次药材均采集于亳州、廉桥等药材市场，分别经湖南中医药大学中药鉴定教研室刘塔斯教授鉴定为正品。试剂：丙酮、石油醚、二氯甲烷为农残级，氯化钠、无水硫酸钠等试剂均为分析纯，水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
DB-1色谱柱 （30 m×0.32 mm×0.25 μm）；进样口：230℃；检测器：300℃；采用程序升温：初温100℃，以10℃/min升至220℃，再以8℃/min升至250℃保持10 min；分流进样，分流比：50∶1；进样量1 μl。载气：高纯氮（纯度＞99.999%），混合对照品出峰顺序为α-BHC、PCNB、γ-BHC、β-BHC、δ-BHC、p，p′-DDE、p，p′-DDD、o，p′-DDT、p，p′-DDT，所得空白溶剂和混合对照品色谱图见图1、图2。
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图1 空白溶剂色谱图
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图2 混合对照品色谱图
2.2 溶液制备
2.2.1 对照品溶液的制备 分别取上述各对照品液（100 μg/ml）各0.5 ml至10 ml量瓶中，加入石油醚（60～90℃）稀释至刻度，即得浓度为5 μg/ml的混合对照品储备液。取混合对照品储备液0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 ml 至5 ml量瓶中，分别加石油醚（60～90℃）稀释至刻度，即得0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/ml的溶液。
2.2.2 样品溶液的制备 取供试品于60℃干燥4 h，粉碎成细粉，过二号筛，取约2 g，置100 ml锥形瓶中，加水20 ml浸泡过夜，加丙酮40 ml，称定重量，超声处理30 min，放冷，用丙酮补足减失的重量，再加氯化钠6 g，加二氯甲烷30 ml，称定重量，超声处理15 min，放冷，用二氯甲烷补足减失的重量，静置使分层。将有机相迅速移入装有无水硫酸钠的100 ml锥形瓶中，放置4 h。取35 ml，于40℃水浴上减压浓缩至近干，加少量石油醚（60～90℃）如前反复操作至二氯甲烷及丙酮除净，用石油醚（60～90℃）溶解并转移至10 ml具塞刻度离心管中，加石油醚（60～90℃）稀释至5 ml，小心加入硫酸1 ml，振摇1 min，3000 r/min离心10 min，取上清液2 ml，置具刻度的浓缩瓶中，连接旋转蒸发器，40℃将溶液浓缩至适量，稀释至1 ml，即得。
2.3 线性关系考察
精密量取上述0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/ml各农药混合对照品溶液，依“2.1”色谱条件分析，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到相应回归方程（表1）。
表1 9种有机氯线性回归方程
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2.4 检出限
配制一系列低浓度溶液进样，以信噪比（S/N=3）测得BHC（α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC）、DDT （p，p′-DDE、p，p′-DDD、o，p′-DDT、p，p′-DDT）、PCNB检出限分别为0.2、0.2、0.2、0.4、0.2、0.2、0.6、0.6、0.4 ng/g。
2.5 重复性试验
取当归（甘肃1）样品5份，按“2.2.2”项下操作制备待测液，按“2.1”色谱条件测定，得到BHC（α-BHC、δ-BHC）、DDT（p，p′-DDD、o，p′-DDT）峰面积值的RSD分别为1.7%、1.0%、2.0%、1.5%，表明方法重复性良好。
2.6 精密度试验
精密吸取1.0 μg/ml混合对照液1 μl，连续进样5次，按“2.1”色谱条件测定，得到BHC（α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC）、DDT（p，p′-DDE、p，p′-DDD、o，p′-DDT、p，p′-DDT）、PCNB峰面积值的RSD分别为1.9%、0.7%、0.4%、1.2%、0.3%、0.4%、0.6%、1.0%、0.8%，表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验
精密吸取1.0 μg/ml混合对照液1 μl，连续在1、8、16、32、48 h进样，按“2.1”色谱条件测定，得到BHC （α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC）、DDT（p，p′-DDE、p，p′-DDD、o，p′-DDT、p，p′-DDT）、PCNB峰面积值的RSD分别为1.2%、1.0%、0.5%、1.0%、1.1%、1.5%、1.9%、1.0%、0.6%，表明样品溶液在48 h内稳定。
2.8 回收率试验
取当归样品9份，每份约2.0 g，精密称定，分3个水平添加混和对照品溶液，每水平重复3次，混匀，自然晾干，按“2.1”项下操作测定，所得结果扣除样品中各农药残留量，计算加样回收率，结果见表2。
2.9 样品测定
准确称取各药材样品，按“2.2.2”项下操作制备待测液，按“2.1”色谱条件测定，结果见表3。
表2 加样回收率试验结果（n=3）
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3 讨论
3.1 色谱及实验条件优化
本实验分别选用SE-54、HP-1、Rtx-1701、DB-1等色谱柱进行比较，最后选用Rtx-1701对各BHC、DDT异构体分离度适中，峰型较好，且最低检出限值相对最低，满足本次有机氯残留量痕量检测要求。本实验有机试剂丙酮、石油醚、二氯甲烷均选用农残级，如用分析纯易对测定产生干扰，尤其是丙酮、石油醚。有机相减压浓缩时，水浴温度不能高于40℃，且减压浓缩务必至近干，避免待测成分损失。
3.2 检测结果
实验结果显示，30批药食两用药材均不同程度地被检出有机氯残留量，尤以当归、党参等根及根茎类药材总含量相对较高，花类药材相对偏低，在2015年版《中国药典》四部中，规定了药材、饮片及制剂中有机氯、有机磷以及拟除虫菊酯类共3类37种农药残留的检测方法，但《中国药典》2015年版一部正文中仅对甘草、黄芪、人参、西洋参、人参茎叶总皂苷、人参总皂苷中有机氯残留量做了限量规定。参考黄芪、甘草药典有机氯残留限量标准［17-19］，总BHC：0.2 mg/kg；总DDT：0.2 mg/kg；PCNB：0.1 mg/kg，本次实验结果均没有超出限度范围，对于当归、党参、金银花等药食两用药材，因其使用的直接性、广泛性和多样化，期望能严格控制其农药残留，尽快建立农药残留限度标准。
3.3 小结及建议
随着我国健康产业发展的迫切需求，中药材尤其是药食两用药材必将成为人们日常疾病预防及保健养生的重要原材料，其质量安全性直接关乎人们生活质量和生命健康，随着世界经济一体化发展进程的加快，中药必然走向国际市场参与竞争，其安全性问题成为关注焦点，同时亦是中医中药全球化发展瓶颈，其农药残留问题必须得到有效控制才足以提高中药材的国际信誉和档次，才能使中医药事业更加健康地向前发展。
针对药食两用药材的农药残留问题，药材生产实施规范化质量管理（GAP）必须严格建立配套的标准、法规，加大监督、处罚力度，对药材生产基地的选择标准、使用农药的种类及使用农药的人员和设备情况、中药加工和仓储的条件、中药中农药残留量的检测方法和限量规定以及监督措施等建立详尽的法规性文件，并采取处罚措施等各种手段保证GAP得以贯彻实施，保证“绿色药材”的生产。对于已污染的土壤如何采用合适的方法降低其农药残留量［20-22］，如以微生物技术投菌法生物修复降解有机氯农药等，从土壤源头来降低和消除种植中药材的农药残留污染问题，改善种植生态环境。
表3 样品中BHC，DDT和PCNB残留量测定结果（mg/kg）
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“-”表示未检出
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GC-ECD testing organochlorine residues in 10 kinds of food and medicine medicinal materials like Angelica sinensis
HE Qing-yan1，2 PI Sheng-ling1，3，4 XIE Jia-chi1，3，4 XIA Bo-hou1，3，4 LI Ya-mei1，3，4▲ LIN Li-mei1，3，4
1.Pharmaceutical College，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China；2.Louxing Branch，Loudi Food and Drug Administration in Hunan Province，Loudi 417000，China；3.Hunan Province Key Laboratory，Hunan Dazong Herbs Quality Evaluation，Changsha 410208，China；4.Chinese Medicine Adverse Ingredients Rapid Detection and Removal Engineering Technology Research Center in Hunan Province，Changsha 410208，China
1.Pharmaceutical College，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China；2.Louxing Branch，Loudi Food and Drug Administration in Hunan Province，Loudi 417000，China；3.Hunan Province Key Laboratory，Hunan Dazong Herbs Quality Evaluation，Changsha 410208，China；4.Chinese Medicine Adverse Ingredients Rapid Detection and Removal Engineering Technology Research Center in Hunan Province，Changsha 410208，China
［Abstract］Objective To explore the residual amount of Organochlorine 666，dichlorodiphenyl trichloroethane and quintozene in 10 kinds of food and medicine medicinal materials like Angelica sinensis，to provide experimental data for the safety evaluate for these food and medicine medicinal materials and to provide further reference for the standard. Methods 30 batches medicinal materials were collected from market and 9 kinds of chlorine pesticide residues were tested by using GC-ECD method.Results The average recovery rate of the methods was 90.97%-103.56%and the RSD was 0.4%-2.7%.Among Angelica sinensis and Codonopsis pilosula that were tested，different levels of organochlorine pesticide residues in them.Conclusion The pesticide residual limitations in food and medicine medicinal materials should be strict controlled.
［Key words］Food and medicine medicinal materials；Organochlorine residues；Electron-capture gas chromatography
［中图分类号］R282.5［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）04（a）-0004-05
（收稿日期：2016-01-10本文编辑：王红双）
［基金项目］湖南省科技基本建设项目（湘发改高技［2013］1199号）；湖南省湖湘青年科技创新创业平台培养对象自主选题项目（湘财教指［2013］158号）；湖南省“十二五”重点学科药学学科项目（湘教发［2011］76号）；湖南省长沙市科技计划项目（K1406030-31）
［作者简介］何清彦（1982-），男，湖南新邵人，硕士，主要从事药物分析研究
▲通讯作者：李亚梅（1987-），女，四川渠县人，硕士，助教，主要从事中药不良成分检测及毒理研究