林堆贤1　梅宝富1　邓志锋1　陈俊辉2
1.深圳市宝安区人民医院介入科，深圳　518101；2.深圳市北京大学深圳医院微创介入科，深圳　518035

[摘要]目的探讨射频消融（RFA）对肺癌患者CD4+T淋巴细胞亚群抗肿瘤免疫功能的影响。方法选取本院2012年8月～2014年8月收治的30例肺癌患者作为研究对象，给予RFA治疗，分别于术前、术后半个月采集外周血，比较治疗前后的Th1、Th2、Th17、Treg细胞水平。结果RFA术后半个月的外周血Th1水平及Th1/Th2比值显著高于术前，Th2、Th17、Treg水平显著低于术前，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论RFA能够改善肺癌患者CD4+T细胞亚群的抗肿瘤免疫功能。

[关键词]肺癌；射频消融；CD4+T淋巴细胞亚群；免疫功能

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在我国城镇居民肿瘤死亡原因中居于首位，大多数患者确诊时已经失去了手术切除的机会[1-2]。射频消融（radiofrequency ab1ation，RFA）的原理是应用频率在460～480 kHz之间的交变高频电流使肿瘤组织内离子发生高速震荡，互相摩擦，将射频能转化为热能，使局部温度达到60～100℃，导致肿瘤组织发生凝固性坏死[2]。2000年Dupuy等[3]首次报道利用RFA治疗肺癌。RFA具有安全性高、创伤小、疗效确切、术后恢复快等特点，已成为肺癌治疗的有效方法之一[2-4]。其在直接损毁肿瘤组织的同时，也可使CD4+T淋巴细胞升高，改善机体的抗肿瘤免疫功能[5-6]。CD4+T细胞为不均一细胞群，研究[7-8]显示，其主要有Th1细胞（辅助性1型T细胞，type 1 he1per T ce11s）、Th2细胞（辅助性2型T细胞，type 2 he1per T ce11s）、Th17细胞（IL-17 producing CD4+T ce11s）、Treg细胞（调节性T细胞，regu1atory T ce11）4种不同的亚群。各淋巴细胞亚群介导不同的免疫功能，在体内又相互作用、相互影响。本研究通过检测Th1、Th2、Th17及Treg4种不同的CD4+T细胞亚群，旨在探讨RFA对肺癌患者CD4+T细胞抗肿瘤免疫功能的影响。

1.1　一般资料

选取2012年8月～2014年8月本科收治的30例肺癌患者作为研究对象，术前均进行穿刺活检或纤维支气管检查，病理确诊为肺癌，其中男19例，女11例；年龄31～70岁，平均48.7岁；腺癌18例，鳞癌12例；Ⅰ期1例，Ⅱ期3例，Ⅲ期17例，Ⅳ期9例。所有患者术前未接受放化疗，无自身免疫性疾病。本研究经本院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 RFA治疗

射频消融采用美国达隆公司生产的RF2000射频治疗仪及可伸展锚状射频电极针，集束电极射频针为套管针，可呈放射状释放出12根微电极针。所有患者采用气管插管静吸复合麻醉，在CT引导下行经皮穿刺肺癌射频消融治疗。术中根据病灶的大小、位置，避开气管、支气管、大血管等重要结构，确定射频电极针的皮肤进针点、穿刺路线及穿刺深度。穿刺射频针到达病灶后，释放微电极，开始RFA治疗，局部病灶内温度可达90～100℃，治疗过程由计算机自动控制。退针时行针道消融。

1.3　CD4+T淋巴细胞亚群的检测

采用流式细胞术检测CD4+T细胞亚群。FACS Canto流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司，荧光素偶联鼠抗人单克隆抗体（CD3-PE-Cy5、CD3-APC、CD4-PE-Cy5、CD8-APC-Cy7、CD25-FITC、IFN-γ-APC、IL-17-FITC、IL-4-PE、foxp3-PE）购自美国BD Bioscience公司。检测方法：治疗前及治疗后半个月清晨用肝素锂抗凝管收集肺癌患者空腹外周静脉血5 m1，即行流式细胞术检测。采用荧光素偶联的单克隆抗体CD3-PE-Cy5、CD8-APC-Cy7、IFN-γ-APC、IL-17-FITC及IL-4-PE对细胞表面抗原及胞内细胞因子进行直接标记，通过检测细胞因子的IFN-γ、IL-4、IL-17分析Th1、Th2、Th17的细胞水平，染色后上机测定各项指标，以FACS Diva软件分析Th1、Th2、Th17细胞占CD4+T细胞的百分率。Treg细胞的特征表型分子是CD3+CD4+CD25+foxp3+，以荧光素偶联的单克隆抗体CD3 -APC、CD4 -PE -Cy5、CD25 -FITC及Foxp3-PE对特征表型分子进行直接标记，染色后上机测定各项指标，以FACS Diva软件分析Treg细胞占CD4+T细胞的百分率。

1.4　统计学处理

采用SPSS 15.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用x2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

RFA术后半个月的外周血Th1水平及Th1/Th2比值显著高于术前，Th2、Th17、Treg水平显著低于术前，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1　RFA术前、术后半月CD4+T细胞亚群检测结果的比较（%，±s）

肿瘤患者免疫功能低下和紊乱，肿瘤细胞所分泌的细胞因子可抑制机体宿主的抗肿瘤反应，免疫功能低下又促进了肿瘤细胞的生长，增加了肿瘤的转移和复发。细胞免疫在机体抗肿瘤免疫中发挥着主要作用，其主要免疫活性细胞为T淋巴细胞，而CD4+T细胞是效应T细胞的重要成分[9]。根据分泌细胞因子不同，CD4+T细胞主要包括Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞及Treg细胞4种亚群，各亚群主要通过分泌不同的细胞因子发挥作用[7，10-11]。Th1细胞主要分泌γ-干扰素（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子β （TNF-β）等[7，10]，活化的Th1细胞及其细胞因子具有较强的抗肿瘤活性和免疫调节作用。IFN-γ可抑制肿瘤血管生成，诱导肿瘤细胞凋亡；IL-2可刺激自然杀伤细胞（natura1 ki11er ce11，NK细胞）杀瘤活性；TNF-β可直接造成肿瘤细胞的凋亡[10，12-13]。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13[10]，IL-4和IL-10可抑制Th1类细胞因子的应答，促进肿瘤生长，与Th1细胞相互拮抗[15-16]，机体Th1型细胞占优势时有利于机体的抗肿瘤反应。肺癌患者存在Th1/Th2免疫失衡，当Th2细胞占优势时，能够抑制Th1型细胞因子的产生，使机体抗肿瘤免疫功能减弱，导致肺癌细胞容易逃避细胞免疫的监视，进而加速肿瘤的进展[12，14-15]。Th17细胞能够特异性地分泌IL-17，而IL-17可以激活活化信号转导与转录激活因子3（signa1 transducer and activator of transcription 3，STAT3），上调血管内皮生长因子（vascu1ar endothe1ia1 growth factor，VEGF）表达，进而促进肺癌血管形成[17]；能够诱导结合锌指蛋白1 （zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）表达，促进肺癌侵袭与转移[18]。Treg细胞能够抑制正常的抗肿瘤功能，与肺癌患者分期与进展相关[19]。通过抑制CD4+和CD8+T细胞的活化、增殖，分泌颗粒酶、穿孔素杀伤效应细胞，介导肿瘤的免疫耐受[10，20]。

已有研究[5-6]显示，RFA术可使肺癌的外周血CD4+T细胞升高，进而改善细胞的抗肿瘤免疫功能。本研究结果显示，RFA术后CD4+T细胞亚群的变化表现为Th1水平及Th1/Th2比值较术前升高，Th2、Th17、Treg细胞水平较术前降低。Th1水平及Th1/Th2值较术前升高有助于纠正Th1/Th2细胞免疫失衡，增强Th1的抗肿瘤免疫功能；Th17细胞水平降低，IL-17分泌减少，可减弱IL-17对肺癌血管促生长及肺癌的侵袭、转移作用。RFA术后外周血Treg细胞降低，有助于减弱Treg细胞对肿瘤患者免疫功能的负调节作用，改善抗肿瘤免疫功能。

综上所述，RFA术利用高温损毁局部肿瘤，可使其完全灭活，在一定时间内又能够改善机体的抗肿瘤免疫功能。其能否对远期效应产生影响，尚需大样本、多中心研究，而RFA引起淋巴细胞变化的机制也需更深入地研究。

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Change of CD4+T lymphocyte subset in patients with lung cancer after radiofrequency ablation

LIN Dui-xian1MEI Bao-fu1DENG Zhi-feng1CHEN Jun-hui2
1.Department of Intervention,Peop1e’s Hospita1 of Baoan District in Shenzhen City,Shenzhen 518101,China；2.Department of Minima11y Invasive Intervention,Shenzhen Hospita1 of Peking University,Shenzhen 518035,China

[Abstract] Objective To exp1ore the inf1uence of the radiofrequency ab1ation （RFA) on the anti-tumor immune function of CD4+T 1ymphocyte subsets in patients with 1ung cancer. Methods 30 patients with 1ung cancer from August 2012 to August 2014 in our hospita1 were se1ected as the research group,the therapy of RFA was given.Periphera1 b1ood was co11ected before and after operation ha1f a month,the 1eve1 of Th1,Th2,Th17,Treg ce11 was compared respective1y. Results The 1eve1 of Th1 and Th1/Th2 ratio after RFA operation at ha1f a month was higher than that before operation, the 1eve1 of Th2,Th17,Treg ce11 after RFA operation at ha1f a month was 1ower than that before operation,with significant difference （P＜0.05). Conclusion RFA can improve the anti-tumor immune function of CD4+T 1ymphocyte subset in patients with 1ung cancer.

[Key words] Lung cancer；Radiofrequency ab1ation；CD4+T 1ymphocyte subset；Immune function

[中图分类号] R734.2　

[文献标识码] A　

[文章编号] 1674-4721（2016）03（b）-0055-03

收稿日期：（2015-12-07　本文编辑：祁海文）