唐梦晨　陈　娇　徐文杰　李　凌
徐州医学院麻醉学院，徐州　221004

［摘要］目的研究银杏叶提取物（EGB）对睡眠剥夺小鼠学习记忆能力的影响及其机制。方法选取成年健康清洁级小鼠48只，雌雄各半，根据随机数字表法将小鼠随机分为4组（n=12）：空白组，对照组，治疗Ⅰ组，治疗Ⅱ组，适应性饲养3天，每组筛选出9只进行造模。应用72 h睡眠剥夺法制作动物模型，用Y迷宫成绩（正确反应次数）评定学习记忆能力，免疫组织化学法反映小鼠海马脑源性神经营养因子（BDNF）的蛋白表达。结果Y迷宫测试结果显示，给药后，对照组与治疗Ⅰ组、对照组与治疗Ⅱ组的正确反应次数差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组给药前后的正确反应次数差异有统计学意义（P＜0.05），其余3组差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，空白组、治疗Ⅰ组、治疗Ⅱ组海马区的BDNF表达增高，其灰度值差异有统计学意义（P＜0.05），但空白组、治疗Ⅰ组、治疗Ⅱ组各组间的灰度值差异无统计学意义（P＞0.05）。结论睡眠剥夺能造成脑损伤、学习记忆能力减退以及BDNF表达减少，EGB可能是通过上调BDNF蛋白及其相关通路蛋白改善睡眠剥小鼠的学习记忆能力。

［关键词］银杏叶提取物；睡眠剥夺；脑源性神经营养因子；学习记忆

Influence of extract of Ginkgo biloba on learning and memory ability in sleeP-dePrivation mice and its study of mechanism

TANG Meng-chen CHEN Jiao XU Wen-jie LI Ling
Schoo1 of Anesthesia of Xuzhou Medica1 Co11ege，Xuzhou 221004，China

［Abstract］Objective To study the inf1uence extract of Ginkgo biloba (EGB) on 1earning and memory abi1ity in s1eepdeprivation mice and its mechanism. Methods Forty-eight hea1thy and c1ean adu1t mice were se1ected，ha1f ma1e and ha1f fema1e，and they were even1y divided into 4 groups according to the random number tab1e method:b1ank group，contro1 group，treatment groupⅠ，and treatment groupⅡ，and they were given adaptive feeding for 3 days，9 mice were se-1ected in each group to make mode1.72-hour of s1eep-deprivation method mode1 was app1ied.The 1earning and memory abi1ity was eva1uated by achievement of Y maze.The protein expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in hippocampa1 area in mice was ref1ected by immunohistochemistry. Results Test resu1t of Y maze showed that，after administration，there was a statistica1 difference of right reaction times between contro1 group and treatment groupⅠ，and between contro1 group and treatment groupⅡ(P＜0.05)；there was a statistica1 difference of right reaction times before and after administration in contro1 group (P＜0.05)，the other three groups had no statistica1 difference (P＞0.05).Compared with contro1 group，BDNF expression of hippocampa1 area in b1ank group，treatment groupⅠ，and treatment groupⅡwas improved，and there was a statistica1 difference of gray va1ue (P＜0.05)，however，there was no statistica1 difference of gray va1-ue among a11 groups (b1ank group，treatment groupⅠ，and treatment groupⅡ) (P＞0.05). Conclusion S1eep-derivation can 1ead to cerebra1 damage，decreased 1earning and memory abi1ity，and reduction of BDNF expression，and EGB may improve 1earning and memory in s1eep-deprivation mice by up-regu1ating BDNF protein and its re1ated pathway protein.

［Key words］Extract of Ginkgo biloba；S1eep-deprivation；Brain-derived neurotrophic factor；Learning and memory

睡眠剥夺（s1eep deprivation，SD）一般指在24 h中的睡眠＜4 h，可以引起生理，心理甚至行为的变化[1]。机体处于正常睡眠状态下，脑内某些蛋白增加，对新突触的建立及学习记忆有很大的促进作用[2]。有研究[3]表明，中长期SD大鼠前额叶皮质脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）免疫阳性物质表达显著减少，可造成脑损伤，影响学习记忆能力。研究[4]表明，BDNF直接参与学习的可塑性，是管理和存储记忆的动力学因素，可能是调控学习和记忆的一个重要分子标志物。在成年中枢系统，BDNF的表达受很多因素的调节，同时通过调节突触的可塑性影响学习记忆[5]。大量研究[6]表明，在正常脑中生理剂量的BDNF对学习记忆有促进作用。

银杏叶提取物（extract of Ginkgo biloba，EGB）已被国内外用于改善脑功能不全患者的学习记忆能力，是一种“认知增强剂”[7]。据报道[8]，EGB具有提高内源性BDNF表达水平的作用，作用机制有待进一步研究。那么，EGB能否改善SD小鼠的学习记忆能力，目前尚无报道。

本研究拟采用行为学、免疫组织化学法等，一方面研究EGB对SD小鼠学习记忆能力的影响，另一方面研究EGB对SD小鼠海马BDNF的影响，进而揭示其可能的作用机制，为寻找能改善SD对学习记忆能力影响的方法提供依据。

1.1　实验动物

选取成年健康清洁级小鼠48只，雌雄各半，体质量为（23±2）g，由徐州医学院动物中心提供。饲养于相对湿度在30%～40%的动物房，光照节律为12L：12D （8:00～20:00），温度为（25±1）℃。根据随机数字表法将小鼠随机分为4组，每组12只，分别为空白组，对照组，治疗Ⅰ组，治疗Ⅱ组。适应性饲养3 d，期间进行站台训练，每天训练30 min，可自由饮水及进食，避免噪声。每组筛选出9只训练合格的小鼠进行造模。

1.2　迷宫训练

实验时先将小鼠放入迷宫适应3 min，灯亮时该臂有电，小鼠受电击后逃到安全区，此区内无灯光。灯光持续10 s后，随机变化电击区，进行下一次测试。每个实验日连续测试20次，记录正确反应次数，所用参数：电压为50～70 V，延时5 s。各组造模前3天进行每天20次的训练，取第3天成绩作为造模前成绩（正确反应次数）；给药后再进行测试。

1.3　动物模型制备

应用改良多平台睡眠剥夺法（modified mu1tip1e p1atform method，MMPM）（72 h睡眠剥夺法）制作动物模型：各组从造模第1天，8:00开始放入睡眠剥夺箱，连续3 d，至第4天早8:00结束。用大鼠笼[规格：48 cm（长）×40 cm（宽）×34 cm（高）]自制简易睡眠剥夺箱，其底面均匀固定9个上表面积2.5 cm×2.5 cm的木平台。箱内注水，平台高出水面0.5 cm，水温保持在室温24～26℃。箱顶置铁丝网。每天更换箱中的水。

1.4　主要药品与试剂

银杏叶片（每片含总黄酮醇苷19.2 mg，萜类内酯4.8 rag，批号：20070403）：贵州信邦制药股份有限公司；BDNF试剂盒：武汉博士德；SABC（兔IgG）：武汉博士德；PBS液：北京中杉金桥；DAB显色剂：武汉博士德。

1.5　实验处理

空白组：正常睡眠，等量去离子水灌胃5 d；对照组：睡眠剥夺，等量去离子水胃5 d；治疗Ⅰ组：睡眠剥夺，EGB 9 m1/10 g灌胃5 d；治疗Ⅱ组：睡眠剥夺，EGB 18 m1/10 g灌胃5 d。给药后第6天开始再次分别对4组小鼠进行行为学检测。

1.6　免疫组织化学检测法

造模结束，经行为学检测，麻醉成功后，将小鼠仰卧固定于手术板上，剪开前胸壁肋骨，暴露心脏，小心分离出升主动脉并在其下穿1根1号手术线备用，将灌注针从心尖插入升主动脉，用准备好的手术线将灌注针固定于升主动脉，在左心耳剪1个小口，输液器接于灌注针尾部，止血钳夹闭腹主动脉，小鼠头低脚高位，快速灌注生理盐水直至流出液变清，再以4℃的4%多聚甲醛继续灌注，直至小鼠头颈变硬，快速断头取脑，取海马，连续冠状切片，PBS漂洗3次，3 min/次，去离子水冲洗；以3%过氧化氢溶液孵育20 min，PBS漂洗3次，3 min/次；正常羊血清封闭（3：200，37℃，15 min）；倾去血清，勿洗，滴加一抗（BDNF兔来源）（1：60，4℃过夜），PBS漂洗3次，3 min/次；滴加二抗（1：200，37℃），孵育10 min，PBS漂洗3次，3 min/次；滴加AB液（1：100，37℃，40 min），PBS漂洗3次，3 min/次；DAB显色（1：20）；最后进行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片，晾干后进行镜下观察、拍照。蛋白表达相对量以灰度值表示。各组随机选取3只小鼠，每只小鼠随机选取3个部位，每个部位9个视野，应用ImageJ软件进行图像分析。

1.7　统计学处理

采用SPSS 13.0软件分析，Y迷宫成绩、海马内BDNF蛋白含量用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One Way-ANOVA）检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1　4组小鼠给药前后正确反应次数的比较

Y迷宫测试结果显示，对照组给药前后的正确反应次数差异有统计学意义（P＜0.05），其余3组差异无统计学意义（P＞0.05）；给药后，对照组与治疗Ⅰ组、对照组与治疗Ⅱ组的正确反应次数差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1　4组给药前后正确反应次数的比较（次，±s）

 

与同组给药前及治疗Ⅰ、Ⅱ组比较，*P＜0.05

2.2　4组小鼠BDNF免疫组织化学染色结果的比较

免疫组织化学染色结果显示，BDNF主要表达于海马细胞的细胞质和细胞膜，呈棕黄色的为阳性。对照组与空白组比较，BDNF蛋白表达明显减少（图1A、图1B）。与对照组比较，空白组、治疗Ⅰ组、治疗Ⅱ组海马区的BDNF表达增高（图1A～图1D），其灰度值差异有统计学意义（P＜0.05），但空白组、治疗Ⅰ组、治疗Ⅱ组各组间灰度值差异无统计学意义（P＞0.05）（图1A、图1C、图1D）（表2）。

 

图1　4组小鼠BDNF的免疫组织化学染色结果

A为空白组，B为对照组，C为治疗Ⅰ组，D为治疗Ⅱ组

表2　4组小鼠BDNF灰度值的比较（±s，n=9）

 

与对照组比较，*P＜0.05

2.3　SD开始前后4组小鼠精神状况与活动能力的比较

SD开始前，4组小鼠饲养条件一致，精神状况与活动能力基本一致，体重持续增长。SD开始后，对照组、治疗Ⅰ组、治疗Ⅱ组精神萎靡、活动减少，且情况持续加重。SD 72 h，36只小鼠均存活。

本实验中，Y迷宫测试结果显示，对照组给药前后的正确反应次数差异有统计学意义，说明SD会造成小鼠学习记忆障碍[9]。给药后，对照组与治疗Ⅰ组、对照组与治疗Ⅱ组的正确反应次数差异有统计学意义，说明EGB对SD小鼠学习记忆有改善作用。

免疫组织化学染色结果显示，EGB可能促进海马BDNF的表达。小鼠海马BDNF的表达增高，对小鼠学习记忆有保护作用；EGB可改善SD小鼠学习记忆障碍，可能是通过上调海马BDNF表达引起的。由此可推测，EGB对改善SD患者的学习记忆障碍有一定作用[10]。目前的研究证实，一定剂量的EGB对认知功能具有改善作用[11-12]。

德国神经生物学家Barde等[13]于1982年首次从猪脑中发现BDNF，目前研究发现，BDNF广泛存在于脑内各个区域，以海马和皮质居多，与疼痛[14]、抑郁[15]、学习记忆[16]等相关，而越来越多的研究[17-19]证实，BDNF在学习记忆中占至关重要的地位，可能与长时程增强（LTP）有关。

本实验中还发现，SD小鼠虽精神萎靡，但攻击性增强，可能处于应激状态。有研究表明[20]，长期应激可使下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）高激活，进而导致体内糖皮质激素异常增高，与海马内存在的大量糖皮质激素受体选择性结合，从而导致海马结构异常。

综上所述，EGB可以保护SD小鼠海马区神经细胞，上调海马区BDNF的表达，提高小鼠的学习记忆能力，且EGB安全性好，无明显毒副作用，来源充足，价格低廉，因此，EGB可以作为改善SD学习记忆能力的药物，值得进一步临床研究。不同剂量EGB对改善SD小鼠学习记忆能力的效果也可作相关研究。

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收稿日期：（2015-09-18　本文编辑：许俊琴）

［作者简介］唐梦晨（1992-），女，江苏连云港人，本科，专业：麻醉学

［基金项目］江苏省大学生创新创业训练计划项目重点课题（201410313025Z）；地方高校国家级大学生创新创业训练计划项目重点课题（201410313025）

［中图分类号］R332　

［文献标识码］A　

［文章编号］1674-4721（2O16）O2（c）-OOO4-O4