·论　著·

卞明心1　沈若武1▲　刻晓彤1　李春雪1　李　玲1　杨永华2
1.青岛大学医学院解剖学教研室，青岛　266071；2.青岛市传染病医院肝病科，青岛　266033

[摘要]　目的探讨蜂胶对创伤愈合的影响，并初步探讨创伤愈合机制。方法60只健康雄性Wistar大鼠随机分为实验组（创伤模型+蜂胶组）20只、对照组（创伤模型+碘伏组）20只、空白组（创伤模型+生理盐水组）20只，每组再随机分为5个时间点（3、5、7、10、14 d），每组每时间点各4只，采用手术法复制大鼠背部皮肤全层1 cm×1 cm的创伤模型，每日换药。分别于各个时间点处死大鼠，切取创面皮肤组织，计算创伤愈合率，通过HE染色观察创面组织学的变化，免疫组织化学染色法检测血管内皮生长因子（VEGF）和血小板源性生长因子（PDGF）的动态改变。结果与对照组比较，实验组能明显提高大鼠创伤愈合速度和愈合率（P＜0.05或P＜0.01）。与空白组比较，HE染色显示实验组毛细血管、胶原纤维增生明显，表皮再生完全。免疫组织化学染色显示，实验组在3 d时VEGF表达水平明显高于对照组（P＜0.05），实验组在5 d时PDGF表达水平明显高于对照组（P＜0.05）。结论蜂胶在创伤修复愈合过程中起明显促进作用，可能与其促进血管生成、促进肉芽组织以及瘢痕组织增生等作用有关。

[关键词]　蜂胶；碘伏；创伤愈合；血管内皮生长因子；血小板源性生长因子；中草药

▲通讯作者：沈若武（1973-），男，山东东营人，副教授，硕士生导师，研究方向：临床应用解剖

蜂胶的药用价值极高，其化学成分包括黄酮类化合物、烯、萜类化合物及大量微量元素等300多种成分，已被证实具有降血糖、抗菌、免疫增强、抗炎，抗氧化等多种药理作用[1-4]，其中抗菌与抗炎作用为创伤愈合提供了药理基础。近年来，国内外已有部分关于蜂胶促愈合的研究，而在临床治疗过程中，碘伏仍是外科创伤的首选消毒、促愈合药物。本文将蜂胶作为促愈合剂用于创伤模型，通过HE染色观察皮肤组织愈合过程，免疫组织化学染色动态观察血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）的表达水平[5]，与碘伏进行对比，观察蜂胶对创伤愈合的影响并初步探究其机制。

1.1　实验动物及分组

成年健康的Wistar大鼠60只，雄性，15周，体质量（280±10）g，购自青岛市药品检验所实验动物中心，动物合格证号：SCXK（鲁）20100010。单笼单只饲养于28℃清洁级动物实验室内。随机分成实验组、对照组和空白组，每组20只。

1.2　创伤模型的建立与干预方法

采用手术法切除大鼠背部皮肤进行造模[6]。造模当天以10%的水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，用剃毛器及脱毛剂于大鼠背部胸段两侧脱毛，暴露皮肤面积约24 cm2。用手术刀于胸段两侧作1 cm× 1 cm切口，切除全层皮肤至深筋膜，形成两个正方形创面。用无菌棉球擦拭止血，实验组涂抹蜂胶（成都宝芝堂生物科技有限公司，G20100714），对照组涂抹碘伏，空白组涂抹生理盐水，拍照记录。用无菌纱布包扎，绷带固定。大鼠每日自由进食、饮水。每日换药，换药前记录创口面积。

1.3　组织取材及处理

分别于手术后3、5、7、10、14 d灌流固定实验动物，每组4只，固定前记录创口面积，不换药。切取以创面为中心的2 cm×2 cm组织块，每只取2块，常规脱水，透明，石蜡包埋，切片，每块组织切3张切片，每组24张，随机分为4个亚组，分别进行常规HE染色，VEGF、PDGF检测采用SABC免疫组织化学染色，并严格按照试剂盒说明进行操作，光镜下观察组织变化。

1.4　免疫组织化学染色结果判断

每个亚组选取6张切片，400倍镜下随机选取5个视野，应用Simple-PCI图像分析系统对组织照片进行定量分析。VEGF的表达以阳性细胞表达百分比表示（阳性细胞百分比=阳性细胞数/视野总细胞数×100%）。阳性细胞主要为胞质着色，表达为棕黄色或棕褐色颗粒。判断标准如下：染色面积＜10%（-），染色面积≥10%（+）。PDGF的表达以平均光密度值表示，阳性细胞主要为胞质着色。

1.5　统计学处理

应用SPSS 20.0统计学软件进行数据处理，计量资料以表示，正态分布检验采用单样本Kolmogorov-Smirnov检验，检验符合正态分布后采用单因素方差分析对各组均数进行比较，各组均数间两两比较采用SNK检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1　3组不同时间创面愈合率的比较

3d时，各组间愈合率差异有统计学意义（F= 10.56，P＜0.01），通过SNK检验，实验组愈合率明显高于对照组（q=3.57，P＜0.01），同时明显高于空白组（q= 4.28，P＜0.01）；5 d时，各组间愈合率差异有统计学意义（F=4.22，P＜0.05），实验组愈合率明显高于空白组（q=2.75，P＜0.05），对照组愈合率明显高于空白组（q= 2.17，P＜0.05）；7 d时，各组间愈合率差异有统计学意义（F=4.58，P＜0.05），实验组愈合率明显高于空白组（q=2.77，P＜0.05），对照组愈合率明显高于空白组（q= 2.44，P＜0.05）；10 d时，各组间愈合率差异无统计学意义（F=0.36，P＞0.05）；14 d时，各组间愈合率差异有统计学意义（F=127.06，P＜0.01），实验组愈合率明显高于对照组（q=5.66，P＜0.05），同时明显高于空白组（q=15.74，P＜0.01），对照组明显高于空白组（q=10.07，P＜0.01）（表1）。

表1　3组不同时间创面愈合率的比较（%，，n=20）

 

与实验组比较，*P＜0.01或*P＜0.05；与对照组比较，#P＜0.01或#P＜0.05；创伤愈合率=（初始创面面积-创面愈合后面积）/初始创面面积×100%

2.2　HE染色结果

3d时，实验组与对照组仍有单核粒细胞渗出，伴有少量毛细血管增生，空白组中性粒细胞渗出明显，炎细胞浸润程度较高。5 d时，实验组出现较多毛细血管增生，肉芽组织生长旺盛，成纤维细胞增生，伤口进入典型增殖期。对照组成纤维细胞数量较少，肉芽组织生长情况较弱。7 d时，实验组肉芽组织进一步生长，生发层开始增厚，毛细血管数量增多，表皮细胞开始从伤口边缘向中心移行。对照组未见表皮细胞的增殖移行。10 d时，各组均有肉芽组织填埋伤口，纤维组织增生明显，瘢痕组织开始形成，实验组新生上皮较厚，移行较快。14 d时，实验组创面已被填埋，上皮完整，愈合基本完成；对照组与空白组上皮较薄，再生不完全（图1）。

 

图1　HE染色显示各组创面不同时间点组织学变化的比较（×100）

2.3　3组不同时间VEGF、PDGF表达水平的比较

VEGF表达水平在3 d时，各组间表达差异有统计学意义（F=4.20，P＜0.05），通过SNK检验，实验组VEGF表达水平明显高于对照组（q=2.66，P＜0.05），同时明显高于空白组（q=2.32，P＜0.05）；5 d时，各组间表达差异有统计学意义（F=3.94，P＜0.05），实验组VEGF表达水平明显高于对照组（q=2.81，P＜0.05）；7 d时，各组间表达差异有统计学意义（F=4.22，P＜0.05），实验组VEGF表达水平明显高于对照组（q=2.56，P＜0.05），空白组VEGF表达水平明显高于对照组（q=2.47，P＜0.05）。PDGF表达水平在5 d时，各组间表达差异有统计学意义（F=6.48，P＜0.05），通过SNK检验，实验组PDGF表达水平明显高于对照组（q=3.56，P＜0.01）；7 d时，各组间表达差异有统计学意义（F=7.685，P＜0.01），实验组PDGF表达水平明显高于对照组（q=3.84，P＜0.01），空白组PDGF表达水平明显高于对照组（q= 2.59，P＜0.05）；10 d时，各组间表达差异有统计学意义（F=6.47，P＜0.05），对照组PDGF表达水平明显高于实验组（q=3.57，P＜0.01）；14 d时，各组间表达差异有统计学意义（F=8.61，P＜0.01），实验组PDGF表达水平明显低于对照组（q=3.78，P＜0.01），同时明显低于空白组（q=3.37，P＜0.01）（表2、图2）。

表2　3组不同时间VEGF、PDGF表达水平的比较（，n=20）

 

与实验组比较，*P＜0.01或*P＜0.05；与对照组比较，#P＜0.01或#P＜0.05

 

图2　免疫组织化学染色检测各组创面VEGF、PDGF表达含量的比较（×100）

蜂胶广泛的药理作用使其即可内服又可外用，并且具有外用创伤药的普遍作用效果[7-8]，在2010年版的《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）中就记载了蜂胶“外用解毒消肿，收敛生肌”的功效[9]，促愈合效果显著。

本实验结果显示，对照组、实验组的创伤愈合率均明显高于空白组（P＜0.05），说明蜂胶具有明显促进伤口愈合的效果。3 d时，实验组创伤愈合率明显高于对照组（P＜0.05），说明蜂胶与碘伏相比，能够有效促进创面的收缩，减少创面面积及表皮爬行范围，加快愈合。从常规HE染色结果得出，实验组肉芽组织从3 d开始出现明显增殖现象，肉芽毛细血管丰富，生长旺盛，加快愈合，说明蜂胶能加快肉芽组织的形成，在一定程度上促进成纤维细胞的增殖，使创伤修复加快进入增殖期。

VEGF是特异性最高同时也是作用最强的血管生长因子，其可促进血管内皮祖细胞增殖，增加血管的通透性，促进血管的生成，同时与肿瘤的发生、发展具有一定的相关性[10-12]。琚晨焰等[13]发现，胃癌组织中VEGF阳性表达率明显较高，与胃癌的发展、侵袭和转移有密切关系。通过动物实验，陈芳等[14]发现，VEGF高水平表达极大地促进了肿瘤血管的生长，对血管内皮细胞的损伤具有拮抗作用。创伤组织中丰富的新生血管为创面提供了充足的氧气和营养物质，保证了肉芽组织迅速增生。本研究免疫组织化学染色中，VEGF在创伤愈合早期起显著作用，实验组3 d时表达水平与对照组、空白组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），说明实验组能有效刺激VEGF的生成，促进伤口组织毛细血管的增生、增殖，为创面愈合提供必需的物质条件。

PDGF能使成纤维细胞和血管内皮细胞直接参与肉芽组织的形成，促进炎症细胞的浸润，促进细胞产物增多，使胶原合成增多，还可以促使VEGF转录和分泌从而促进血管生成[15-18]。Hom等[19]通过病例研究发现，使用PDGF治疗可以促使患者伤口内肉芽组织得到充分填埋；LaRochelle等[20]发现，PDGF与卵巢、肾、肺等部位的癌症患者均有一定的相关性，可促进肿瘤的侵袭。创面组织中PDGF的含量高低可以很好地反映创面增殖期伤口的愈合情况。本研究免疫组织化学染色中，PDGF在5 d时呈高表达，5、7 d时表达水平与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明实验组能够更早形成大量的肉芽组织，激发肉芽组织的增殖生长，加快创面充填，加速愈合。

综上所述，蜂胶在创伤修复方面疗效可观，与单纯擦拭碘伏相比具有更好的促愈合效果，值得在临床创伤修复治疗中推广应用。

致谢：感谢夏玉军教授对文章讨论部分提出的宝贵意见，感谢李阳、严金光同学对实验过程的大力协助。

[1]　罗照明，张红城.中国蜂胶化学成分及其生物活性的研究[J].中国蜂业，2012，63（2）：55-62.

[2]　于倩，林静，祖力卡尔江·阿合买提，等.伊犁黑蜂蜂胶对口腔主要致龋细菌生物膜作用的实验研究[J].华西口腔医学杂志，2015，33（4）：343-346.

[3]　高蓬勃，徐响，高丽苗，等.蜂胶化学成分与地理源、植物源的研究进展[J].食品安全质量检测学报，2015，6（8）：3172-3176.

[4]　王启海，黄文斌，韩军，等.蜂胶总黄酮对全脑缺血-再灌注损伤大鼠脑组织病理学及细胞凋亡的影响[J].中药材，2015，30（6）：1488-1492.

[5]　顾永峰.皮肤创伤愈合过程的研究[J].亚太传统医药，2010，6（7）：165-166.

[6]　付万进，王晖，庞玉新，等.皮肤创伤模型研究进展[J].广东药学院学报，2013，29（2）：214-218.

[7]　张晓义，唐祝奇，刘春，等.鲜蟾皮外敷促进糖尿病大鼠皮肤溃疡愈合的实验研究[J].交通医学，2013，27（5）：435-438.

[8]　张溪，廖成静，贾赤宇.芦荟在烧伤创面应用的研究进展[J].中华损伤与修复杂志（电子版），2015，10（1）：80-82.

[9]　国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：337.

[10]　王佳琪，王国栋，颜红柱，等.生长因子在创伤愈合中作用的研究[J].创伤外科杂志，2013，15（3）：281-283，289.[11]　宁尼亚，刘松凡.VEGF与卵巢癌的研究进展[J].中国当代医药，2014，21（22）：186-188.

[12]　薛栋，赵海霞，常刚，等.人胰腺癌中Livin及血管内皮生长因子的表达及其临床意义[J].国际肿瘤学杂志，2014，41（9）：700-703.

[13]　琚晨焰，胡小云，张文昌，等.胃癌组织中Galectin-3和VEGF的表达及其临床意义[J].南昌大学学报（医学版），2010，50（3）：25-28，139.

[14]　陈芳，薛远，曹义海，等.肿瘤相关性恶液质：VEGF作用机制的实验研究[J].中国肺癌杂志，2009，12（4）：283-288.

[15]　屈纪富，郝利，孙薇，等.细胞因子在创伤愈合过程中的变化及其意义的研究进展[J].创伤外科杂志，2003，5（1）：74-76.

[16]　Gassmann MG，Stanzel A，Werner S.Growth factor-regulated expression of enzymes involved in nucleotide biosynthesis：a novel mechanism of growth factor action[J].Oncogene，1999，18（48）：6667-6676.

[17]　Wang XR，Wang CD，Liu XM，et al.Effect of PDGF-Rb antagonist imatinib on endometrial injury repairing in mouse model[J].Asian Pac J Trop Med，2015，8（7）：555-559.

[18]　Wu CF，Chiang WC，Lai CF，et al.Transforming growth factor β1stimulates profibrotic epithelial signaling to activate pericyte-myofibroblast transition in obstructive kidney fibrosis[J].Am J Pathol，2013，182（1）：118-131.

[19]　Hom DB，Manivel JC.Promoting healing with recombinant human platelet-derived growth factor—BB in a previously irradiated problem wound [J].Laryngoscope，2003，113 （9）：1566-1571.

[20]　LaRochelle WJ，Jeffers M，Corvalan JR，et al.Platelet-derived growth factor D：tumorigenicity in mice and dysregulated expression in human cancer[J].Cancer Res，2002，62（9）：2468-2473.

The effect of propolis on wound healing of skin in rats

BIAN Ming-xin1SHEN Ruo-wu1▲LIU Xiao-tong1LI Chun-xue1LI Ling1YANG Yong-hua2
1.Department of Anatomy，Medicine College of Qingdao University，Qingdao 266071，China；2.Department of Liver Disease，Qingdao Hospital of Infectious Diseases，Qingdao 266033，China

[Abstract]　Objective To discuss the influence of propolis on wound healing and study preliminarily on the mechanism of wound healing.Methods 60 healthy and male Wistar rats were randomly divided into experimental group (wound model+propolis，n=20)，control group (wound model+povidone iodine，n=20) and blank group (wound model+physiological saline，n=20).Each group was then randomly divided into 5 time points:3 d，5 d，7 d，10 d and 14 d with there were 4 rats in each time point.The wound model was established by full-thickness skin injury in rats' back in size of 1 cm×1 cm，changed dressings every day.The rats were executed in every time point and the injuried skin tissues were cut to calculate the wound healing rate，and the change of wound histology was observed by hematoxylin-eosin (HE) staining and the dyanmic change of vascular endothelial growth factor(VEGF) and platelet-derived growth factor(PDGF) was detected by immunohistochemical staining method respectively.Results Compared with control group，the experimental group could obviously improve the healing speed and healing rate of wound in rats (P＜0.05 or P＜0.01).Compared with blank group，HE staining revealed that remarkable capillary and collagen fiber hyperplasia，and complete epidermal regeneration was observed in experimental group.Immunohistochemical staining revealed that the expression level of VEGF in experimental group was significantly higher than that of control group in 3 d (P＜0.05).The expression level of PDGF was greatly higher than that of control group in 5 d (P＜0.05).Conclusion The propolis plays a significant promotion role in healing and repair of wound，it may be related to promoting angiogenesis，the role of promoting proliferation of granulation tissue and scar tissue.promote the rebuilding of capillaries，acceletate the regeneration of the epidermis and facilitate the formation of scar.

[Key words]　Propolis；Povidone-iodine；Wound healing；Vascular endothelial growth factor；Platelet-derived growth factor；Chinese herbal medicine

[中图分类号]　R285.5　

[文献标识码]　A　

[文章编号]　1674-4721（2016）01（c）-0011-04

[基金项目]　山东省高等学校科技计划项目（J14LK10）

[作者简介]　卞明心（1992-），女，山东滨州人，青岛大学2011级口腔医学专业本科在读

收稿日期：（2015-09-23　本文编辑：许俊琴）