·基础医学·

李玉芳1　杨智航1　杨　宇1　倪月秋1　邢爱平2
1.沈阳医学院基础医学院生理教研室，沈阳　110034；2.沈阳医学院，沈阳　110034

[摘要]　目的建立大鼠线粒体DNA（mtDNA）缺失突变模型，探讨mtDNA缺失突变对顺铂耳毒易感作用的影响。方法选取Wistar大鼠随机分为实验组和对照组，每组20只。其中实验组大鼠以皮下注射阿霉素（DOX）2 mg/kg体重，每周2次，共3个月，对照组则以生理盐水取代DOX。然后两组均连续腹腔注射顺铂2 mg/kg，共6 d。用药前后测试听觉脑干诱发电位（ABR）阈值，并用PCR技术对大鼠内耳膜迷路mtDNA 4834 bp缺失突变进行检测。结果大鼠内耳组织mtDNA检测发现，实验组有13/20只存在4834 bp片段缺失，而对照组未检测到片段缺失；两组大鼠用顺铂前后，ABR阈值提高，两组均数间差异有统计学意义（P＜0.05）。结论DOX可诱导大鼠内耳组织mtDNA缺失突变。大鼠内耳组织mtDNA缺失可增加其对顺铂耳毒作用的敏感性。

[关键词]　mtDNA缺失；阿霉素；顺铂耳毒易感

顺铂是目前临床上最常用的有效广谱抗癌药物之一，但在化疗过程中所引起的严重不良反应如耳毒性和肾毒性作用[1-2]限制了它的使用。本实验通过阿霉素诱导动物内耳线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突变建立动物模型，在此基础上给予顺铂，检测大鼠内耳组织mtDNA片段缺失情况及应用顺铂前后听觉脑干诱发电位（auditory brainstem response，ABR）阈值变化的对应关系，探讨大鼠内耳组织mtDNA片段缺失与顺铂耳毒易感的关系，从而进一步明确顺铂耳毒性的作用机制。

1.1　实验动物

成熟健康、耳廓反射灵敏、无中耳疾患的Wistar大鼠40只，体重250～400 g，雌雄不拘，由沈阳医学院动物实验中心提供。

1.2　主要试剂与仪器

顺铂冻干粉（齐鲁制药厂，批号20100408）；阿霉素（doxorubicin，DOX；浙江海门制药厂，批号185801）；TUNEL测定试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。实验器材：YJC-A型诱发电位仪（泰安市高新医疗器械厂）；解剖显微镜，BIOMETRA-PCR仪（德国），Eppen-dorf AG紫外分光光度计（美国）。

1.3　动物分组及用药

随机分为实验组和对照组，各20只。实验组：建立mtDNA缺失模型[3]，皮下注射DOX 2 mg/kg体重，每周2次，共3个月，再连续腹腔注射顺铂每日2 mg/kg体重，共6 d。对照组：用生理盐水替代DOX，用药方法及时间同实验组。

1.4　ABR的检测

实验组和对照组所有大鼠在注射DOX或生理盐水前以及顺铂前后各测1次ABR，所有测试在隔音屏蔽室内进行。先将大鼠2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定安插针式电极，其中记录电极置于颅顶，参考电极和接地电极分别置于同侧和对侧乳突部。采用YJC-A型诱发电位仪进行检测：用短声刺激，声源距耳1 cm，频率10次/s，放大器增益4000倍，通频带为80～3000 Hz，叠加200次，结果以波群中Ⅲ波消失或Ⅳ波刚出现时的短声刺激强度的分贝（dB）值为反应阈值。分别记录各组动物ABR阈值变化情况。

1.5　内耳膜迷路mtDNA的提取及PCR扩增

大鼠在3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉下，迅速断头，取出两侧听泡，快速置于预冷4℃的充氧细胞外液中（0.1 mol/L PBS，pH 7.4）。在体视显微镜下解剖出Corti器和蜗轴、椭圆囊、球囊及壶腹嵴等结构。每只动物两侧内耳相同组织合在一起，置入EP管中加TE缓冲液200 μl匀浆后加入细胞裂解液，最后加1%胰蛋白酶，37℃温水浴中孵育24 h。

采用经典酚-氯仿-异戊醇法提取DNA。经过酶消化、提取、洗涤、干燥等步骤提取组织中DNA。将提取的DNA溶于20 μl TE缓冲液中；利用Eppendorf AG紫外分光光度仪测定A260nm、A280nm吸光度，计算DNA浓度及纯度：DNA纯度A260nm/A280nm＞1.8；DNA质量浓度（μg/μl）=（DNA的A260nm×50×DNA稀释倍数）/1000。

参照Seidman等[4]报道的核苷酸序列设计引物，特异扩增mtDNA 4834 bp片段丢失后断裂融合基因的引物核苷酸序列（上海生工公司合成）如下。P1：5'-GCGAAGCTTAGAGCGTTAAC-3'-7701；P2：5'-AGTGAGATAAGGAGGCCTGC-3'-13110。

PCR反应Buffer采用康维公司CW0682D循环：94℃1 min，94℃20 s、52℃退火30 s、72℃延伸1 min，共循环32次；末次72℃延伸5 min。PCR扩增产物加GeneFinder后在1%～2%琼脂糖凝胶中电泳，分析结果。

1.6　统计学处理

所有实验数据均采用SPSS 13.0统计软件处理，计量资料用均数±标准差（）表示，ABR反应阈值分析采用t检验，各组用药前后ABR阈值采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1　内耳组织mtDNA 4834 bp缺失突变检测结果

实验组内耳组织4834 bp缺失突变共13只，阳性率为65%，对照组内耳组织4834 bp缺失突变均为阴性。

按本实验特异性设计的引物，丢失后断裂融合目标基因片段长度为597 bp。PCR产物电泳结果：实验组在标准标记核酸690 bp和520 bp之间有1条清晰的目的DNA条带，提示内耳组织存在4000～5000 bp 的mtDNA片段缺失（图1）。

 

图1　大鼠内耳mtDNA PCR扩增产物

1～5泳道为实验组，其中2～5泳道为阳性，C泳道为对照组，为阴性

2.2　ABR测试结果

实验组和对照组动物在应用顺铂后，ABR阈值较应用顺铂前均提高，两组数据比较差异均有统计学意义（P＜0.05），且应用顺铂后ABR阈值实验组较对照组明显增高，两组数据比较异均有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1　两组动物ABR阈值变化情况的比较（dB peSPL，）

 

与用顺铂前比较，*P＜0.05；与对照组比较，#P＜0.05

顺铂是目前临床常用的有效广谱化疗药物之一，但由于其对耳和肾脏的毒性作用，限制了它的应用[5]。目前对于肾毒性作用机制的研究较多，可采用水化疗法和应用利尿剂等保护措施减轻其肾毒性，而对于其耳毒性发病机制的研究相对滞后，严重的耳毒性不良反应是影响顺铂治疗乃至停药的重要因素，因此，探讨顺铂耳毒性发病机制及其防治方法等有极重要的价值。

mtDNA是唯一存在于细胞质中的DNA分子，呈裸露状态，没有组蛋白的保护，同时缺乏有效的修复系统，在复制时有不对称状态，出现的单链DNA有自发的脱氨基效应，而且复制频率较高，是产生氧自由基的主要场所，更是内源性自由基攻击的靶部位，对氧自由基毒性作用十分敏感。

本实验采用DOX诱导动物内耳mtDNA突变[3]，在慢性应用DOX后，65%的实验大鼠内耳组织中检测到mtDNA 4000～5000 bp缺失突变，而在对照组未检测到这种突变，研究结果表明，DOX可诱导大鼠内耳mtDNA缺失突变。

本研究将实验组大鼠内耳mtDNA缺失突变检测阳性和检测阴性动物注射顺铂前后ABR反应阈值进行分析发现，用DOX诱导mtDNA缺失突变的动物组在施用顺铂后，其ABR平均反应阈显著提高；而对照组在施用顺铂后，其ABR平均反应阈仅轻度提高，均数间差异有统计学意义（P＜0.05），且对照组mtDNA 4000～5000 bp缺失突变检出率为0，提示mtDNA缺失突变与顺铂耳毒性密切相关。

顺铂耳毒性的作用机制尚不十分清楚，存在代谢障碍、钙离子紊乱、氧化应激损伤学说、细胞凋亡等多种学说[1]。目前有关顺铂的自由基致聋机制逐渐引起较多的关注，认为自由基的损伤可能是顺铂耳毒性的主要原因之一。耳蜗具有高代谢及产生活性氧的能力，在正常情况下体内活性氧不断产生的同时不断被体内防御系统清除。顺铂与耳蜗组织结合后可激发产生大量的自由基，使内耳组织发生过氧化反应，同时伴随大量过氧化酶的消耗，产生内耳毒性，说明氧自由基在顺铂耳中毒早期扮演着重要的角色，是顺铂耳毒性的重要原因[6-8]。

有研究表明，人mtDNA突变及大鼠mtDNA缺失可增加其对氨基苷类药物耳毒性作用的敏感性[9-11]，我们课题组在国家自然基金资助课题中发现氨基苷类药物可促使体内活性氧自由基产生，导致mtDNA突变[12]，这类人即使仅使用少量甚至一次耳毒性药物即能发生耳聋。

本实验提示，内耳mtDNA缺失突变与顺铂耳毒性密切相关，其机制可能是大鼠mtDNA 4834 bp缺失核苷酸位nt7701～13110之间，线粒体含有三羧酸循环、氧化磷酸化及呼吸链等一系列复杂酶系，在能量产生中不可替代，故该片段缺失后可导致呼吸链酶蛋白合成及线粒体氧化磷酸化功能障碍，造成呼吸链中断，ATP生成减少[13]，而内耳ATP生成减少可引起耳蜗内离子失平衡、内环境紊乱，从而导致大量氧化自由基的产生，而由DOX导致的大鼠内耳mtDNA 4834 bp缺失，与顺铂作用于内耳组织后产生的大量自由基发生蓄积作用，超出内耳细胞的清除能力，导致核酸的损伤进一步加重，形成恶性循环，并且可以改变正常细胞周期，导致细胞周期折返，甚至诱发受累细胞凋亡[14]，因此推断大鼠内耳mtDNA缺失突变是顺铂的耳毒性作用机制之一，可增加大鼠对顺铂耳毒性作用的敏感性，这为如何开展用药前遗传筛查和基因诊断，用药后加强对早期临床症状的监控，积极辅以药物治疗[15]奠定了理论基础。

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The influence of mtDNA deletion mutantion on the ototoxicity susceptibility of cisplatin

LI Yu-fang1YANG Zhi-hang1YANG Yu1NI Yue-qiu1XING Ai-ping2
1.Department of Physiology，Basic Medical College of Shengyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Shengyang Medical College，Shenyang 110034，China

[Abstract]　Objective To establish an animal model of mitochondrial DNA (mtDNA) deletion mutantion and to investigate the influence of mtDNA deletion mutantion on the ototoxicity susceptibility role of cisplatin.Methods Wistar rats were randomly divided into experimental group and control group，and there were 20 rats in each group.Doxorubicin (DOX) was subcutaneously injected at dose of 2 mg/kg twice per week for 3 months in experimental group.Control group was identical to experimental group，except normal saline was substituted for DOX.Cisplatin was intraperitoneally injected 2 mg/kg per day for 6 consecutive days in both groups.Auditory brainstem response (ABR) threshold was tested and 4834 bp deletion mutantion of mtDNA in inner ear membranous labyrinth for rats was tested by PCR technique.Results In experimental group，13 of the 20 rats were demonstrated 4834 bp mtDNA deletion，while control group was negative.ABR threshold was improved before and after cisplatin used in rats，and there was a statistical difference of mean between two groups (P＜0.05).Conclusion In the inner ear tissue of the rat，DOX can induce mtDNA deletion mutantion.mtDNA deletion of the inner ear tissue of the rat can increase its sensitivity of ototoxicity role of cisplatin.

[Key words]　mtDNA deletion；Doxorubicin；Ototoxicity susceptibility of cisplatin

[中图分类号]　R764　

[文献标识码]　A　

[文章编号]　1674-4721（2016）01（c）-0102-03

[基金项目]　辽宁省科计厅计划项目（2009225009-23）

[作者简介]　李玉芳（1970-），女，辽宁沈阳人，教授，研究方向：药物中毒性耳聋机制及心脑血管疾病机制

收稿日期：（2015-06-01　本文编辑：许俊琴）