蒋莉娟1　　皮胜玲2　　方铁铮1　　姚江雄1　　许招懂1　　林丽美2▲
1.广州白云山星群（药业）股份有限公司，广州　510208；2.湖南中医药大学药学院，长沙　410208

[摘要]目的建立东风桔药材HPLC指纹图谱，结合化学计量手段，对多批次药材进行质量控制。方法采用Kromasil 100-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以乙腈（A）-0.5％冰乙酸水（B）为流动相系统梯度洗脱（0～30 min，20％→50％A；30～70 min，50％→100％A），流速为1.0 ml/min，检测波长为254 nm，柱温35℃。对12批药材样品进行相似度分析、聚类分析和主成分分析。结果建立了东风桔药材专属性的HPLC指纹图谱，标示了18个共有指纹峰，12批样品分为5大类。结论将HPLC指纹图谱与化学计量手段相结合，可有效对东风桔药材进行真伪鉴别和质量评价，为其质量控制方法提供参考。

[关键词]东风桔；高效液相色谱法；指纹图谱；相似度评价；聚类分析；主成分分析

东风桔为芸香科植物酒饼簕[Atalantia buxifolia （Poir.）Oliv.]的根及根茎部分，产于海南、台湾、福建、广东、广西等地，通常见于离海岸不远的平地、缓坡及低丘陵的灌木丛中，其气香，味微辛、苦，性温，具有祛风散寒，行气止痛的功效。与其他草药配用治支气管炎、风寒咳嗽、感冒发热、风湿关节炎、慢性胃炎、胃溃疡及跌打肿痛等[1]。主要含有挥发油、柠檬苦素类、生物碱、香豆素类、黄酮类等成分。东风桔的药用历史悠久，民间历来沿用本品治疗急、慢性气管炎，目前广东各大医院用于临床治疗慢性支气管炎，且取得较好的临床效果。研究证实，其有化痰、止咳、平喘的药理活性[2-3]。东风桔有较高的开发利用价值，应用前景良好，但目前尚未有东风桔药材的质量控制标准。本研究建立东风桔药材的HPLC指纹图谱，为东风桔药材的真伪鉴别和质量控制提供科学依据，为进一步开发和利用东风桔资源、发展道地药材生产提供参考。

1.1　仪器

KQ-100B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；T-214型电子分析天平（Denver公司）；Waters e2695高效液相色谱系统，Empower工作站，含四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器（Waters公司）。

1.2　材料

冰乙酸（天津市化学试剂研究所，色谱纯）；乙腈（Honeywell公司，色谱纯）；水为超纯水（实验室制备）。12份不同批次或产地的东风桔药材样品[广州星群（药业）股份有限公司]，由中药鉴定教研室龚力民老师鉴定为芸香科植物酒饼簕的干燥根及根茎，具体信息见表1。

表1　东风桔药材样品来源

2.1　色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.5％冰乙酸水（B）为流动相系统梯度洗脱（0～30 min，20％→50％A；30～70 min，50％→100％A）；流速：1.0 ml/min；检测波长：254 nm；柱温：35℃；进样体积：10 μl。

2.2　供试品溶液的制备

取东风桔药材粉末（过60目筛）约0.5 g，精密称定，置100 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 ml，密塞，称重，70℃回流水浴加热45 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3　方法学考察

2.3.1　精密度试验　取同一产地（广西）药材粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，测定指纹图谱。以9号峰的保留时间和峰面积为参照，计算样品中所含18个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。各共有峰相对保留时间的RSD为0.001％～0.1％，相对峰面积的RSD为0.022％～2.38％，表明仪器的精密度良好。

2.3.2　重复性试验　取同一产地（广西）药材粉末，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别进样6次，测定指纹图谱。考察样品中所含18个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间的RSD为0.008％～0.07％，相对峰面积的RSD为0.060％～2.47％，表明方法的重复性良好。

2.3.3　稳定性试验　取一份（广西）药材粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、4、8、12、15、24 h测定指纹图谱，考察样品中所含18个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间的RSD为0.001％～0.3％，相对峰面积的RSD为0.088％～2.27％，表明东风桔药材样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4　指纹图谱的建立

2.4.1　指纹图谱共有模式的建立　取12批药材粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μl，记录HPLC色谱图（图1）。采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版）进行分析，生成共有模式指纹图谱，标定了18个共有峰（图2）。其中以峰9为参照物，其余各共有峰与峰9的相对保留时间与相对峰面积见表2、表3。

 

图1　12批东风桔药材HPLC指纹图谱

 

图2　东风桔药材HPLC对照指纹图谱

表2　东风桔药材HPLC指纹图谱共有峰相对保留时间

2.4.2　指纹图谱的相似度评价　上述12批东风桔药材相似度计算结果依次为0.975、0.981、0.933、0.959、0.961、0.972、0.973、0.994、0.996、0.954、0.966、0.955，说明样品批次之间差异性较小，质量稳定。

2.5　聚类分析

将12批东风桔药材HPLC指纹图谱中18个色谱峰的峰面积与样品号建立矩阵，导入SPSS 19.0软件，采用组间联接法，以欧氏距离的平方为测度，对数据进行标准化转换，得到东风桔药材的聚类分析谱图（图3）。结果表明，12批样品可分为5类，S1、S2聚为一类，S4、S5聚为一类，S8、S9聚为一类，S6、S7、S10、S11、S12聚为一类，S3单独聚为一类。

 

图3　聚类分析图

2.6　主成分分析

采用SPSS 19.0软件对12批东风桔药材样品进行主成分分析。结果表明，S6、S7、S10、S11、S12集中分布在一个区域，可聚为一类，其余样品根据距离远近可分为4类。该图直接反映了各批次样品之间的差异大小，与聚类分析的结果一致（图4）。

 

图4　主成分分析图

3.1　提取方法的考察

考察了水浴回流提取法和超声提取法[4-6]，结果发现水浴回流提取的收率较超声提取高；对提取溶剂甲醇、50％甲醇、75％甲醇、乙醇、50％乙醇、75％乙醇进行了考察[7-10]，发现甲醇的提取效果最好；同时对提取体积10、20、25、30 ml和提取时间15、30、45、60 min也进行了考察，发现10 ml提取45 min时效率最高。

3.2　色谱条件的优化

尝试了乙腈-0.5％冰乙酸水、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.5％冰乙酸水不同流动相体系[11-15]，结果表明，乙腈-0.5％冰乙酸水系统得到的色谱峰峰形较好且稳定；比较了245、254、265、300、320 nm波长下的色谱图，结果在254 nm检测条件下色谱峰较多，各峰吸收均匀，峰形较好，故选择254 nm作为检测波长；比较了Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm）、LiChrospher®100 RP-18 endcapped（5 μm）Hibar®RT 250-4.6、Athena C18120A（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）4种不同型号的色谱柱，结果表明Kromasil柱的各色谱峰的分离度、峰形较其他色谱柱好，本实验选择Kromasil色谱柱。

3.3　聚类分析和主成分分析

两者相互佐证，结果一致，可以看出样品被分为5大类：Ⅰ（S1，S2），Ⅱ（S4，S5），Ⅲ（S3），Ⅳ（S8，S9），Ⅴ（S6，S7，S10，S11，S12）。分析其结果，Ⅳ类与Ⅴ类距离最近，Ⅱ类与Ⅴ类距离最远，Ⅰ～Ⅴ类各类之间相距较远，说明药材的主要成分类似，但其含量不同，不同批次或产地的同种药材之间存在一定差异[16-20]。本实验对东风桔的HPLC指纹图谱进行多方面的考察，结果准确、可靠，可用于东风桔药材的质量控制。

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JIANG Li-juan1PI Sheng-ling2FANG Tie-zheng1YAO Jiang-xiong1XU Zhao-dong1LIN Li-mei2▲
1.Guangzhou Baiyunshan Xingqun Pharmaceutical Co.,Ltd.,Guangzhou 510208,China;2.School of Pharmacy,Hunan U-niversity of Chinese Medicine,Changsha 410208,China

[Abstract] Objective To establish the HPLC fingerprint chromatogram of Atalantia buxifolia coupled with chemometrics means for the quality control of multi-batches of medicinal material. Methods The samples were analyzed on Kromasil 100-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）column with a acetonitrile（A）-0.5％acetic acid（B）as the mobile phase（0-30 min, 20％→50％A;30-70 min,50％→100％A）at a flow rate of 1.0 ml/min.The detective wavelength was 254 nm and the column temperature was at 35℃.12 samples was constructed for similarity evaluation,cluster analysis and principle component analysis. Results A specificity HPLC fingerprint spectrum was developed for Atalantia buxifolia,18 common peaks were indicated and 12 samples were divided into 5 groups. Conclusion With the combination of chemometrics means, the HPLC fingerprint chromatogram provides a method for evaluation of authenticity and quality control of Atalantia buxifolia,which is favorable to improve quality control of Atalantia buxifolia.

[Key words] Atalantia buxifolia;HPLC;Fingerprint;Similarity evaluation;Cluster analysis;Principle component analysis

收稿日期：（2015-08-12本文编辑：王红双）

通讯作者：▲林丽美，女，博士，硕士生导师，主要从事中药药效物质基础及其质量标准化研究

[作者简介]蒋莉娟（1967-），女，高级工程师，主要从事新药研发

[基金项目]国家科技重大专项课题（2013ZX09201019）

[中图分类号] R284.1　

[文献标识码] A　

[文章编号] 1674-4721（2016）01（b）-0014-04